小麥肽的抗氧化與抗疲勞作用研究

王倩倩1，杜鵑2，陳鳴2，馮鳳琴1,*

(1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江杭州310012；

2.杭州康源食品科技有限公司，浙江杭州310012)

摘要：目的：探討小麥肽的體外抗氧化活性和體內(nèi)抗疲勞作用。方法：通過H2O2誘導小鼠成纖維細胞L929構建氧化應激損傷模型，測定損傷后L929細胞的存活率、乳酸脫氫酶(lacticdehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物(glutathioneperoxidedismutase,GSH-Px)活力以及丙二醛(MDA)含量，從細胞水平評價小麥肽的抗氧化作用。然后通過力竭游泳和自由泳實驗，測定力竭游泳時間、乳酸(lacticacid,LA)、尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)和肌糖原(muscleglycogen,MG)含量、SOD和GSH-Px)活力以及MDA含量，來評價小麥肽的體內(nèi)抗疲勞和抗氧化作用。結果：小麥肽濃度在0.4、0.8mg/mL時對L929細胞的H2O2損傷有極顯著的保護作用；與模型組相比，小麥肽濃度為0.6和0.8mg/mL時的LDH活力分別顯著下降了20.79%和19.67%、SOD活力分別顯著和極顯著的提高了83.21%和95.19%、GSH-Px活力分別提高了28.69%和32.14%，MDA含量分別顯著下降了25.91%和26.99%。體內(nèi)抗疲勞實驗表明，與對照組相比，2個劑量組的小鼠力竭游泳時間分別顯著延長了72.93%和91.73%，LA含量分別極顯著下降了24.65%和25.16%、BUN含量分別極顯著和顯著下降了19.74%和17.78%，MG含量分別極顯著提高了48.63%和56.85%；體內(nèi)抗氧化結果表明，2個劑量組的SOD和GSH-Px活力分別極顯著提高了20.54%、25.91%和29.79%、35.77%，MDA含量分別極顯著下降了23.08%和21.46%。Pearson相關性分析表明小麥肽的體內(nèi)抗疲勞與抗氧化作用高度相關。結論：小麥肽具有顯著的抗氧化和緩解疲勞作用，且抗氧化活性與抗疲勞作用高度相關。

關鍵詞：小麥肽，小鼠，抗氧化，抗疲勞，自由基

StudyontheAntioxidantand

Anti-fatigueEffectofWheatPeptides

WANGQian-qian1,DUJuan2,CHENMing2,FENGFeng-qin1,*

(1.CollegeofBiosystemsEngineeringandFoodScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310012,China;

2.HangzhouKangyuanFoodScience&TechnologyCo.,Ltd,Hangzhou310012,China)

Abstract: Objective: To investigate the in vitro antioxidant activity and in vivo anti-fatigue effect of wheat peptides. Methods: The oxidative stress model was established by treating L929 cells with H2O2. Then the cell survival rate, the activity of lactic dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxide dismutase (GSH-Px), and the content of malondialdehyde (MDA) were measured to evaluate the antioxidant activity of wheat peptides in vitro. In addition, the exhaustive swimming and freestyle swimming test was assessed. Then the exhaustive swimming time, the content of lactic acid (LA), blood urea nitrogen (BUN), muscle glycogen (MG) and MDA, the activity of SOD and GSH-Px were measured to studied the anti-fatigue and antioxidant of wheat peptides in vivo. Results: The wheat peptides in the concentration range from 0.4 to 0.8 mg/mL could protect L929 cells against H2O2-induced oxidative damaged as indicated by highly significantly increased the survival rate. Compared to the model group, the activity of LDH of the wheat peptides at 0.6 and 0.8 mg/mL was significantly decreased by 20.79% and 19.67%, the activity of SOD was highly significantly and significantly increased by 83.21% and 95.19%, the activity of GSH-Px was increased by 28.69% and 32.14%, and the content of MDA was significantly decreased by 25.91% and 26.99%. Compared with the control group, the exhaustive swimming time of the wheat peptides at 2 and 8 mg/mL was significantly increased by 72.93% and 91.73%, the content of LA was significantly decreased by 24.65% and 25.16%, the content of BUN was highly significantly and significantly decreased by 19.74% and 17.78%, and the content of MG was highly significantly increased by 48.63% and 56.85%. At the same time, the activity of SOD and GSH-Px was highly significantly increased by 20.54% and 25.91%, 29.79% and 35.77%, and the content of MDA was highly significantly decreased by 23.08% and 21.46%. Pearson correlation analysis showed that the antifatigue effect of wheat peptides was highly correlated with its antioxidant activity. Conclusion: Wheat peptide had significant antioxidant activity and anti-fatigue effect, and the anti-fatigue effect of wheat peptide was correlated with antioxidant activity.

Key words: wheat peptides; mice; antioxidant; anti-fatigue; free radical

中圖分類號：TS201.4文獻標志碼：Adoi:10.13386/j.issn1002-0306.2020100066

近年來，隨著生活節(jié)奏的加快和社會壓力的增大，大部分人都處于亞健康的狀態(tài)，因此越來越多人開始通過各種運動方式來提升自己的身體機能。在正常情況下，合理的體育鍛煉有助于身體更好的發(fā)揮功能。但由于自身條件的不同以及運動量的不合理，他們經(jīng)常會因為過度的運動導致身體的不適，引起身體的疲勞，從而影響工作效率，甚至造成各種運動性損傷，危及損害身體健康^[1]。關于運動性疲勞的機制有幾種學說，包括耗竭學說、阻塞學說、自由基學說、內(nèi)環(huán)境失調(diào)學說、保護性抑制學說和突變學說^[2]。其中自由基學說認為機體在高強度或長時間運動時會產(chǎn)生過量的自由基，如羥基自由基和超氧陰離子自由基，過多的自由基會破壞體內(nèi)氧化和抗氧化平衡，引起肝臟和骨骼肌線粒體的脂質(zhì)過氧化損傷，最終導致疲勞^[3]。因此保護機體不受氧化傷害是預防疲勞的有效方法^[4-5]。外源性抗氧化物質(zhì)能與內(nèi)源性自由基相互作用，減少機體氧化損傷、增強機體抗氧化防御能力、減少疲勞產(chǎn)生。近年來，營養(yǎng)干預特別是多肽類營養(yǎng)保健品受到越來越多研究者的關注，大量研究表明多肽在緩解疲勞方面是安全有效的^[6-8]。與蛋白質(zhì)相比，多肽類補充劑能夠被機體更快更好地吸收，且能夠加快氨基酸、蛋白質(zhì)和葡萄糖的利用速率^[9]。

小麥肽是小麥蛋白經(jīng)過酶解得到的結構片段，其氨基酸含量均衡，具有多種功能活性，如抗氧化^[10-11]、解酒^[12]、免疫調(diào)節(jié)^[13-14]、降血糖^[15]、保護腸粘膜^[16]、促進胃粘膜修復^[17]等。研究表明酶解產(chǎn)物的氨基酸組成可能與其生物活性有關^[18]。小麥肽氨基酸組成中谷氨酸的含量最高，而谷氨酸中谷氨酰胺含量豐富^[19]。谷氨酸對神經(jīng)系統(tǒng)具有積極的作用并且在運動過程中是有用的^[20]，谷氨酰胺是谷胱甘肽合成的重要底物，在機體的抗氧化體系中具有重要作用。運動性疲勞的產(chǎn)生和氧化應激之間存在著很大的關系，已經(jīng)成為抗疲勞領域研究的熱點。但目前關于小麥肽的功能活性研究主要集中在小麥肽的體外抗氧化方面，而對體內(nèi)抗疲勞的研究較少。另外小麥肽作為一種新的食品原料來源尚未得到廣泛應用。因此，我們以小麥肽為研究對象，利用H2O2誘導小鼠成纖維細胞L929氧化損傷，從細胞水平評價小麥肽的體外抗氧化活性，然后通過給予小鼠灌胃小麥肽30天，測定小鼠力竭游泳時間和與疲勞相關的生化指標，探討小麥肽的抗疲勞作用，并探求體內(nèi)抗氧化活性和抗疲勞作用之間的相關性，從氧化應激的角度來解釋小麥肽的抗疲勞機制，以期為小麥肽作為功能性食品基料提供數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1材料與儀器

小鼠成纖維細胞L929購買于中科院上海細胞庫，L929細胞用RPMI1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清和1%雙抗，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，當細胞融合至80%以上后，進行傳代。SPF級ICR雄性小鼠64只，體重約(20±2)g，實驗動物許可證編號為SYXK(浙)2018-0012，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供和飼養(yǎng)，自由進食標準顆粒飼料及飲水，保持環(huán)境溫度(25±2)℃，光照周期12h:12h條件下適應性飼養(yǎng)一周后使用。乳清蛋白粉購于市場；胎牛血清浙江天杭生物科技股份有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、雙抗(青霉素、鏈霉素)、0.25%胰酶上海源培生物科技股份有限公司；乳酸(LA)、尿素氮(BUN)、肌糖原(MG)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒南京建成生物工程研究所；其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋常州澳華儀器有限公司；PB-10pH計、BSA224S電子分析天平賽多利斯科學儀器有限公司；752型紫外-可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；Ultimate3000高效液相色譜儀美國賽默飛世爾科技有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機安徽中佳科學儀器有限公司；InfiniteM200Pro酶標儀瑞士帝肯集團公司；MCO-170AICUVDL-PCCO2細胞培養(yǎng)箱日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社；DM500光學顯微鏡徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1小麥肽的制備稱取一定量的谷朊粉，調(diào)節(jié)料液的pH至8.0，添加0.4%蛋白酶，于50℃下酶解1.5h后置于沸水浴中滅酶30min，經(jīng)濃縮、噴霧干燥制得小麥肽。

1.2.2小麥肽特性的測定

1.2.2.1氨基酸組成采用異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法[21]測定小麥肽的氨基酸組成。樣品溶解于6mol/LHCl，然后于110℃水解24h后冷卻，取6μL水解液置于離心管中，氮氣吹干后加入10μL再干燥液，吹干后加入20μL衍生溶液混勻，室溫靜置20min后再次氮氣吹干，加入50μL流動相B，混勻后加入450μL流動相A，過膜上機。

色譜條件：色譜柱為WelchAQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相A為0.1mol/L乙酸鈉溶液(含3%乙腈和0.1%三乙胺)，流動相B為80%乙腈；流速1.0mL/min；柱溫38℃；進樣量20μL；檢測波長254nm。

1.2.2.2相對分子質(zhì)量分布采用凝膠過濾色譜測定小麥肽的相對分子質(zhì)量分布^[22]。色譜條件：色譜柱為TSKgelG2000SWXL(300mm×7.8mm，5μm)；流動相為乙腈-超純水-三氟乙酸(體積比45:55:0.1)；流速0.5mL/min；柱溫30℃；進樣量20μL；檢測波長220nm。

1.2.3體外抗氧化活性的測定

1.2.3.1細胞損傷模型的建立選擇對數(shù)生長期的L929細胞，稀釋細胞個數(shù)為5×10⁴個/mL，接種于96孔板中，每孔接種100μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，棄去舊培養(yǎng)基，然后進行分組：空白組不加細胞，只加培養(yǎng)基；對照組加入不含H2O2的培養(yǎng)基，實驗組加入不同濃度的H2O2(40、80、120、160、200、250、300、350μmol/L)。24h后，用CCK-8法檢測細胞存活情況，通過公式(1)計算細胞存活率。

1.2.3.2小麥肽對L929細胞生長的影響選擇對數(shù)生長期的L929細胞，稀釋細胞個數(shù)為5×10⁴個/mL，接種于96孔板中，每孔接種100μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。24h后，棄去舊培養(yǎng)基，然后進行分組：空白組不加細胞，只加培養(yǎng)基；對照組加入不含樣品的培養(yǎng)基，實驗組加入不同濃度的小麥肽(0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL)。24h后，用CCK-8法檢測細胞存活情況，通過公式(1)計算細胞存活率。

1.2.3.3小麥肽對H2O2誘導L929細胞損傷的保護作用選擇對數(shù)生長期的L929細胞，稀釋細胞個數(shù)為5×10⁴個/mL，接種于96孔板中，每孔接種100μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，棄去舊培養(yǎng)基，然后進行分組：實驗組加入不同濃度的小麥肽(0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL)；正常對照組和H2O2損傷組加入不含樣品的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后棄去舊培養(yǎng)基，H2O2損傷組和樣品組加入300μmol/L的H2O2，正常組加入不含H2O2的完全培養(yǎng)基，作用24h后，用CCK-8法檢測細胞存活情況，通過公式(1)計算細胞存活率^[23]。

1.2.3.4抗氧化指標測定選擇對數(shù)生長期的L929細胞，稀釋細胞個數(shù)為5×10⁴個/mL，接種于6孔板中，每孔接種2mL。培養(yǎng)24h后進行分組：正常對照組、H2O2模型組、不同濃度小麥肽組(0.4、0.6、0.8mg/mL)。細胞經(jīng)過不同樣品和H2O2處理后，收集細胞和培養(yǎng)液進行各指標的測定。分別用試劑盒提供的方法測定上清液中LDH活力，細胞內(nèi)SOD活力、GSH-Px活力和MDA含量。

1.2.4抗疲勞實驗

1.2.4.1動物分組及給藥雄性ICR小鼠64只，體重約(20±2)g，按照體重隨機分為4組，分別為對照組(蒸餾水，同等劑量)、陽性組(乳清蛋白，2mg/g/d)、小麥肽低劑量組(2mg/g/d)、小麥肽高劑量組(8mg/g/d)，每組16只，根據(jù)小鼠重量給予不同劑量的受試物，灌胃量按0.1mL/10g，每日1次，連續(xù)30d，灌胃期間自由取食和飲水。灌胃30d后，將每組的16只小鼠隨機分為2個亞組(每個亞組8只小鼠)，即A組和B組，A組小鼠用于力竭游泳實驗，B組小鼠用于自由泳實驗測定抗疲勞相關生化指標。具體的動物實驗設計如表1所示。

表1動物實驗設計

Table1Experimentaldesignofanimals

1.2.4.2力竭游泳實驗末次灌胃30min后，將每組中的A組小鼠用肥皂水洗去其體表油脂，然后在小鼠尾根部負荷5%體重的鉛絲，放入水溫25℃、水深約30cm的游泳箱中游泳。游泳期間若有躬腰停止、懸浮休息者，用玻璃棒攪動附近水流迫使其不停運動。用秒表記錄自游泳開始至小鼠頭部全部沉入水中7s不能浮出水面的時間，該時間作為小鼠的力竭游泳時間。

1.2.4.3疲勞相關生化指標測定末次灌胃30min后，將每個實驗組中的B組小鼠眼球取血，靜置15min后，離心取上清液，-80℃保存?zhèn)溆?。然后將采血后的小鼠立即處死，?/span>出肝臟和后腿肌肉，按照1:9的比例加入相應體積的生理鹽水，磨勻漿后得到10%的組織勻漿液，-80℃保存?zhèn)溆?。分別用試劑盒提供的方法測定小鼠血清中LA和BUN含量、肌肉中MG含量、肝臟中MDA含量、SOD和GSH-Px活力。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，采用單因素方差分析比較組間差異，結果以均值±標準差表示，數(shù)據(jù)圖表用GraphPadPrism8.0軟件制作。

2.1氨基酸組成和相對分子質(zhì)量分布

圖1小麥肽的相對分子質(zhì)量分布

Fig.1Relativemolecularweightdistributionofwheatpeptides

肽的生物活性與其氨基酸組成相關。由表2可知，小麥肽含有18種肽的生物活性與其氨基酸組成相關。由表2可知，小麥肽含有18種氨基酸，總量為76.66%，表明小麥肽含有豐富的氨基酸組成。其中谷氨酰胺和脯氨酸是最主要的氨基酸，含量分別為22.91%和9.92%。而谷氨酰胺是一種重要的具有特殊營養(yǎng)作用的條件性必需氨基酸及腸道必需氨基酸，它在保護細胞膜的完整性、維持細胞活力及降低細胞氧化損傷方面具有積極的作用^[24]。半胱氨酸含有可電離的硫醇基團，能夠清除自由基并結合金屬離子^[25]；組氨酸結構上含有咪唑環(huán)，可以與金屬離子和活性氧結合^[26]；甲硫氨酸含有硫醚基團，對特定氧化劑有反應^[27]；酪氨酸含有酚羥基，通過提供氫原子來清除活性氧^[28]。因此，以上4種氨基酸被普遍認為具有抗氧化活性^[29]。另外，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸這類支鏈氨基酸不僅可以明顯改善運動能力，延緩運動過程中肌肉蛋白質(zhì)的分解代謝，而且還能減少運動后乳酸的積累，從而延緩血乳酸引起的疲勞。由表2可知，小麥肽中具有抗氧化活性的半胱氨酸、組氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸這4種氨基酸含量為6.31%。同時，小麥肽中亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸這3種支鏈氨基酸的含量較高為13.22%。因此，小麥肽富含抗氧化與抗疲勞活性的氨基酸，推測其可能具有一定的抗氧化與抗疲勞的潛能。

除了氨基酸組成，肽的生物活性也取決于其相對分子質(zhì)量的分布，分子量小于3000Da的肽被認為比分子量大于3000Da的肽具有更好的抗氧化活性，這種較好的活性可能是由于分子量小的肽段具有高活性、易吸收和低毒性^[30]。由表3可知，小麥肽相對分子質(zhì)量小于3000Da的部分占70.56%，推測其具有一定的抗氧化效果。

2.2體外抗氧化

2.2.1小麥肽對H2O2誘導L929細胞損傷的保護作用

圖2小麥肽對L929細胞氧化損傷的保護作用

Fig.2ProtectiveeffectofwheatpeptidesagainstH2O2inducedoxidativedamageinL929cells

注：與對照組相比，*代表差異顯著P＜0.05，**代表差異極顯著P＜0.01；與模型組相比，#代表差異顯著P＜0.05，

##代表差異極顯著P＜0.01，圖3同。

通過H2O2處理小鼠成纖維細胞L929制備氧化應激損傷模型，來探討小麥肽的體外抗氧化活性。如圖2A所示，與對照組相比，當H2O2濃度為300μmol/L作用24h時，細胞存活率為52.39%，因此選擇該濃度的H2O2進行下一步實驗。如圖2B所示，與對照組相比，濃度在0.2~0.8mg/mL范圍內(nèi)的小麥肽對L929細胞均具有增殖作用，濃度為0.4mg/mL時對細胞的增殖作用最強，且差異極顯著(P＜0.01)。當濃度大于0.8mg/mL時，小麥肽對L929細胞的增殖有一定的抑制作用。因此我們選擇濃度為0.2~0.8mg/mL的小麥肽進行下一步實驗。小麥肽對L929細胞氧化損傷的保護作用結果如圖2C所示。與模型組相比，在H2O2損傷前24h加入0.2~0.8mg/mL的小麥肽均能提高L929細胞的存活率，且隨著濃度的升高，細胞存活率隨之增加。當小麥肽濃度為0.6mg/mL時，對L929細胞的保護作用最顯著(P＜0.01)，此時細胞存活率比模型組的提高了45.62%。綜合兩組實驗結果表明小麥肽濃度為0.4~0.8mg/mL時對H2O2誘導L929細胞氧化損傷的保護作用較顯著(P＜0.01)。

2.2.2小麥肽對H2O2誘導L929細胞損傷的抗氧化水平的影響正常細胞經(jīng)由H2O2處理后，細胞膜被破壞從而導致細胞內(nèi)的LDH釋放。因此，上清液LDH活力的高低可反映出細胞的損傷程度。由圖3A可知，L929細胞經(jīng)H2O2損傷后細胞培養(yǎng)液中LDH活力極顯著升高了53.10%(P＜0.01)，說明模型建立成功。與模型組相比，小麥肽濃度為0.4、0.6和0.8mg/mL時LDH的活力分別減少了7.20%、20.79%和19.67%，且濃度在0.6mg/mL和0.8mg/mL時差異達到顯著(P＜0.05)。SOD和GSH-Px是機體內(nèi)主要的抗氧化酶，SOD催化活性氧分解生成H2O2和O2，GSH-Px催化H2O2分解生成H2O和O2，它們能直接反應機體的抗氧化水平。而MDA是自由基引起脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一，可間接顯示機體清除氧化產(chǎn)物能力和抗氧化活性[31]。由圖3B和圖3C可知，與模型組相比，小麥肽濃度為0.4、0.6和0.8mg/mL時SOD活力提高了23.55%、83.21%和95.91%，且在濃度為0.6mg/mL和0.8mg/mL時差異達到顯著(P＜0.05)和極顯著(P＜0.01)；同時GSH-Px活力提高了11.38%、28.69%和32.14%，但差異均不顯著(P＞0.05)。由圖3D可知，3個濃度的小麥肽使得細胞內(nèi)的MDA含量降低了10.52%、25.91%和26.99%，且在濃度為0.6mg/mL和0.8mg/mL時差異達到顯著(P＜0.05)。體外抗氧化實驗表明小麥肽具有抑制體內(nèi)氧化應激的潛力。

圖3小麥肽對L929細胞氧化損傷LDH、SOD、GSH-Px和MDA水平的影響

Fig.3EffectofwheatpeptidesagainstH2O2inducedoxidativedamageinL929cellsontheSOD,GSH-Px,MDAandLDH

2.3.1體重變化由表4可知，在實驗期間，各樣品組與對照組小鼠的體重均有所增加，但體重變化無顯著性差異。灌胃期間，小鼠無不良反應，體質(zhì)量增加正常，精神狀態(tài)良好，未發(fā)現(xiàn)異?；蛘咚劳霈F(xiàn)象，表明灌胃小麥肽并不會影響小鼠的正常生長，對小鼠無毒副作用。

2.3.2小麥肽對小鼠力竭游泳時間和抗疲勞指標的影響

圖4小麥肽對小鼠力竭游泳時間、乳酸、尿素氮和肌糖原水平的影響

Fig.4Effectofwheatpeptidesontheexhaustiveswimmingtime,LA,BUNandMG

注：與對照組相比，*代表差異顯著P＜0.05，**代表差異極顯著P＜0.01，圖5同。

力竭游泳時間是評價抗疲勞能力的一種實驗模型，它能夠很好地評價小鼠的疲勞耐受能力，再現(xiàn)性較高^[32]。由圖4A可知，小麥肽低劑量組、高劑量組和乳清蛋白組小鼠的力竭游泳時間較對照組均有極顯著差異(P＜0.01)，分別延長了72.93%、91.73%和64.66%，且高劑量組與乳清蛋白組有顯著差異(P＜0.05)。另外，隨著小麥肽劑量的增加，其力竭游泳時間也隨著延長，表明在一定范圍內(nèi)，小鼠力竭游泳時間呈劑量依賴性。長時間的劇烈運動會增加肌肉的氧氣消耗，導致機體相對缺氧，此時肌肉中的糖原會被分解產(chǎn)生乳酸，為機體提供能量。但大量的乳酸的產(chǎn)生則會影響機體內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡，引起肌肉酸痛，導致肌肉運動能力的下降。同時為了滿足能量需求，蛋白質(zhì)的代謝顯著增加，使肝臟中的尿素水平明顯增加，過量的尿素會在體內(nèi)積累并對機體造成危害。BUN的含量在一定程度上可以反映機體的疲勞程度^[33-34]。由圖4B和4C可知，與對照組相比，小麥肽低劑量和高劑量組均使得小鼠肝臟中的LA含量極顯著降低了24.65%(P＜0.01)、25.16%(P＜0.01)，同時BUN含量較對照組也極顯著和顯著降低了19.74%(P＜0.01)、17.78%(P＜0.05)，表明小麥肽可加快LA和BUN的清除速度，減少了代謝產(chǎn)物的堆積和體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝，具有改善能量代謝，加速疲勞消除的作用，從而提高了小鼠的運動耐力。糖原是體內(nèi)儲存能量的主要形式之一，能夠與糖在機體內(nèi)進行轉(zhuǎn)化作用，肌糖原通過無氧酵解的途徑直接將能量供給肌肉組織[35]。由圖4D可知，小麥肽低劑量和高劑量組MG含量比對照組極顯著提高了48.63%(P＜0.01)、56.85%(P＜0.01)。根據(jù)《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》，若1項以上(含1項)的運動實驗和2項以上(含2項)的生化指標為陽性，可判定該受試物具有抗疲勞作用。小麥肽低劑量和高劑量組的運動指標和3項生化指標均呈陽性，說明小麥肽通過延長小鼠力竭游泳時間，降低運動小鼠血清中乳酸和尿素氮含量，減少運動引起的肌糖原消耗，具有顯著的抗疲勞作用。

2.3.3小麥肽對小鼠肝臟抗氧化水平的影響

圖5小麥肽對小鼠SOD、GSH-Px和MDA水平的影響

Fig.5EffectofwheatpeptidesontheSOD,GSH-PxandMDA

以往的研究表明，劇烈運動過程中消耗大量的能量，會使氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失去平衡，產(chǎn)生過多的活性氧，如羥基自由基和超氧陰離子自由基，這些自由基極易引起骨骼肌與肝臟線粒體的脂質(zhì)過氧化損傷，從而削弱抗氧化能力。在劇烈運動中，人體對氧氣的需求會增加，骨骼肌的血流量也會改變。這些變化導致自由基的產(chǎn)生和肌肉穩(wěn)態(tài)的紊亂，導致骨骼肌的氧化損傷，隨后的炎癥反應和細胞因子的產(chǎn)生，進一步導致肌肉疲勞[36]。因此，清除活性氧可能是緩解肌肉疲勞的主要機制之一。由圖5A和5B可知，與對照組相比，小麥肽低劑量和高劑量組均使得小鼠肝臟中的SOD極顯著提高了20.54%(P＜0.01)、25.19%(P＜0.01)，同時GSH-Px活力較對照組也極顯著提高了29.79%(P＜0.01)、35.77%(P＜0.01)；由圖5C可知，與對照組相比，小麥肽低劑量和高劑量組均使得小鼠肝臟中的MDA含量極顯著降低了23.08%(P＜0.01)、21.46%(P＜0.01)。結果表明，小麥肽能夠提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶的活力，清除因運動而產(chǎn)生的自由基，緩解疲勞，具有較強的體內(nèi)抗氧化能力。

2.3.4體內(nèi)抗氧化和抗疲勞的相關性分析我們將體內(nèi)抗氧化指標和抗疲勞指標進行Pearson相關性分析[37]，得到結果如表5所示。從表中可以看到，各個處理組的SOD活力、GSH-Px活力與小鼠力竭游泳時間、MG含量呈正相關，與LA含量、BUN含量呈負相關；MDA含量與小鼠力竭游泳時間、MG含量呈負相關，與LA含量、BUN含量呈正相關。結果表明，小麥肽的抗疲勞活性與其抗氧化活性高度相關。

3結論

本研究通過H2O2處理小鼠成纖維細胞L929來制備氧化應激損傷模型，從細胞水平評價小麥肽的體外抗氧化活性，然后通過給予小鼠灌胃小麥肽30d，測定小鼠力竭游泳時間和與疲勞相關的生化指標，探討小麥肽的抗疲勞作用，并探求體內(nèi)抗氧化活性和抗疲勞作用之間的相關性。體外抗氧化結果表明，H2O2損傷導致L929細胞存活率降低，細胞上清液中LDH漏出量增多且能夠顯著造成細胞內(nèi)抗氧化酶SOD和GSH-Px活性降低及細胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的增加。但當提前加入小麥肽對樣品進行預保護后，可通過提高細胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性、減少MDA含量，發(fā)揮其抗氧化作用。體內(nèi)抗疲勞結果表明小麥肽通過延長小鼠力竭游泳時間，降低運動后LA及BUN的水平，增加MG的含量，提高內(nèi)源性抗氧化酶體系的活力，減緩疲勞的發(fā)生。通過對體內(nèi)抗氧化和抗疲勞相關性分析可知，抗氧化活性與抗疲勞能力高度正相關，因此后續(xù)可進行與氧化應激相關的信號通路進行驗證。

參考文獻

[1] 吳良文, 陳寧. 運動性疲勞的機制與大豆多肽對其調(diào)控的研究進展[J]. 食品科學, 2019, 40(17): 302-308.

[2] Wang L, Zhang H L, Lu R, et al. The decapeptide CMS001 enhances swimming endurance in mice[J]. Peptides, 2008, 29(7):1176-1182.

[3] Harman D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry[J]. The Journals of Gerontology, 1956, 11(3): 298-300.

[4] Elliott J L, Lal S. Blood pressure, sleep quality and fatigue in shift working police officers: Effects of a twelve hour roster system on cardiovascular and sleep health[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2016, 13(2): 172.

[5] Trudel X, Brisson C, Milot A, et al. Effort-reward imbalance at work and 5-year changes in blood pressure: the mediating effect of changes in body mass index among 1400 white-collar workers[J]. International Archives of Occupational and Environmental Health, 2016, 89(8): 1229-1238.

[6] Zhang Y Y, Ryu B, Cui Y H, et al. A peptide isolated from Hippocampus abdominalis improves exercise performance and exerts anti-fatigue effects via AMPK/PGC-1α pathway in mice[J]. Journal of Functional Foods, 2019, 61: 103489.

[7] Guo Z B, Lin D Q, Guo J J, et al. In vitro antioxidant activity and in vivo anti-Fatigue effect of sea horse (Hippocampus) peptides[J]. Molecules, 2017, 22(3): 482.

[8] Liu R, Wu L, Du Q, et al. Small molecule oligopeptides isolated from walnut (Juglans regia L.) and their anti-fatigue effects in mice[J]. Molecules, 2018, 24(1): 45.

[9] Van Loon L J C, Saris W H M, Kruijshoop M, et al. Maximizing post exercise muscle glycogen synthesis: carbohydrate supplementation and the application of amino acid or protein hydrolysate mixtures[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 2000,72(1):106-111.

[10] Zhang J X, Wen C T, Li C Z, et al. Antioxidant peptide fractions isolated from wheat germ protein with subcritical water extraction and its transport across Caco-2 cells[J]. Journal of Food Science, 2019, 84(8): 2139-2146.

[11] 于蘭蘭, 劉偉, 周雅琳, 等. 小麥低聚肽對急性酒精中毒小鼠抗氧化功能的影響[J]. 食品科學, 2020, 41(7): 159-163.

[12] 曾瑜, 潘興昌, 張立實, 等. 小麥低聚肽對小鼠解酒功能的評價[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學, 2019, 46(7):1255-1259.

[13] 代卉, 施用暉, 韓芳, 等. 小麥肽免疫活性及抗氧化作用的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2009, 21(3): 473-476. [14] Zheng Z Q, Yang X X, Liu J, et al. Effects of wheat peptide supplementation on anti-fatigue and immunoregulation during incremental swimming exercise in rats[J]. RSC Advances, 2017, 7(69): 43345-43355.

[15] Sun S L, Zhang G W, Mu H Y, et al. The mixture of corn and wheat peptide prevent diabetes in NOD mice [J]. Journal of Functional Foods, 2019, 56: 163-170.

[16] 潘興昌, 印虹, 谷瑞增, 等. 小麥肽對大鼠氮代謝以及胃腸黏膜結構和功能的影響[J]. 食品科學, 2013,34(5):264-269.

[17] Kan J T, Cheng J R, Xu L M, et al. The combination of wheat peptides and fucoidan protects against chronic superficial gastritis and alters gut microbiota: a double-blinded, placebo-controlled study [J]. European Journal of Nutrition, 2019, 59(4): 1655.

[18] Hao G X, Cao W H, Hao J M, et al. In vitro antioxidant activity and in vivo anti-fatigue effects of oyster (Ostrea plicatula gmelin) peptides prepared using neutral proteinase [J]. Food Science and Technology Research, 2013, 19(4): 623-631.

[19] 王延州, 劉麗婭, 鐘葵, 等. 高谷氨酰胺低聚小麥肽制備用酶的篩選[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014, 30(2): 177-181, 187.

[20] Guezennec C Y, Abdelmalkia A, Seirurier B, et al. Effects of prolonged exercise on brain ammonia and amino acids [J]. International Journal of Sports Medicine, 1998, 19(5): 323-327.

[21] 呂艷. 酶解小麥蛋白制取谷氨酰胺活性肽的研究[D].杭州: 浙江大學, 2005.

[22] 丁樹慧, 齊曼婷, 齊斌, 等.低值海洋魚低聚肽抗氧化和抗疲勞活性[J]. 食品科學, 2019, 40(1):163-169

[23] Kumer J P, Mandal B B. Antioxidant potential of mulberry and non-mulberry silk sericin and its implications in biomedicine [J]. Free Radical Biology and Medicine, 2017, 108: 803-818.

[24] Zieglerer F, Seddiki L, Marion-letellier R, et al. Effects of l-glutamine supplementation alone or with antioxidants on hydrogen peroxide-induced injury in human intestinal epithelial cells[J]. e-SPEN, the European e-Journal of Clinical Nutrition and Metabolism, 2011,6(4): e211-e216.

[25] Poole L B. The basics of thiols and cysteines in redox biology and chemistry[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2015, 80:148-157.

[26] Ihara H, Kakihana Y, Yamakage A, et al. 2-Oxo-histidine-containing dipeptides are functional oxidation products[J]. Journal of Biological Chemistry, 2019, 294(4): 1279-1289.

[27] Manta B, Gladyshev V N. Regulated methionine oxidation by monooxygenases[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2017, 109:141-155.

[28] Torkova A, Koroleva O, Khrameeva E, et al. Structure-functional study of tyrosine and methionine dipeptides: an approach to antioxidant activity prediction[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16(10): 25353-25376.

[29] Matsui R, Honda R, Kanome M, et al. Designing antioxidant peptides based on the antioxidant properties of the amino acid side-chains[J]. Food Chemistry, 2018, 245: 750-755.

[30] Dei Piu L, Tassoni A, Serrazanetti D I, et al. Exploitation of starch industry liquid by-product to produce bioactive peptides from rice hydrolyzed proteins[J]. Food Chemistry, 2014, 155: 199-206.

[31] Luo C H, Xu X R, Wei X C, et al. Natural medicines for the treatment of fatigue: bioactive components, pharmacology, and mechanisms[J]. Pharmacological Research, 2019, 148: 104409.

[32] Hu L S, Fang X Z, Du M H, et al. Anti-fatigue effect of blended camellia oleifera abel tea oil and Ge-132 in Mice[J]. Food and Nutrition Sciences, 2015, 6(15): 1479-1487.

[33] Zhang X Y, Jing S, Lin H J, et al. Anti-fatigue effect of anwulignan via the NRF2 and PGC-1α signaling pathway in mice[J]. Food & Function, 2019, 10(12): 7755-7766.

[34] Tung Y T, Wu M F, Lee M C, et al. Antifatigue activity and exercise performance of phenolic-rich extracts from Calendula officinalis, Ribes nigrum, and Vaccinium myrtillus[J]. Nutrients, 2019, 11(8): 1715.

[35] Liu Y Y, Liu C J. Antifatigue and increasing exercise performance of Actinidia arguta crude alkaloids in mice[J]. Journal of food and drug analysis, 2016, 24(4): 738-745.

[36] Yang D K, Lee S J, Adam G O, et al. Aralia continentalis kitagawa extract attenuates the fatigue induced by exhaustive exercise through inhibition of oxidative stress[J]. Antioxidants. 2020, 9(5): 379.

[37] You L J, Ren J Y, Yang B, et al. Antifatigue activities of loach protein hydrolysates with different antioxidant activities[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(50): 12324-12331.