Effsect of Casein Phosphopeptides on the Bone Mineral Density in Aged Ovariectomized Rat

馮鳳琴¹，王博誠(chéng)²，許時(shí)嬰³，王璋³，金堅(jiān)²

（¹浙江大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系，杭州 310029；²江蘇源自醫(yī)學(xué)研究所，無(wú)錫 214036；³江南大學(xué)食品學(xué)院，無(wú)錫 214036）

FENG Fengqin¹,WANG Bo-cheng²,XU Shi-ying³,WANG Zhang³,JIN Jian²

(¹Department of Food Science and Nutrition,Zhejiang University,Hangzhou 310029;

²Jiangsu Institute of Nuclear Medicine,Wixi 214036;

³School of Food Science,Wuxi University of Light Industry,Wuxi 214036,China)

酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides,簡(jiǎn)稱CPP)是以牛乳酪蛋白為原料,經(jīng)單一酶或復(fù)合酶水解,再經(jīng)分離純化而得到的含有成簇的磷酸絲氨?；亩嚯?。Mykkanen等在正常雞和佝僂病雞上進(jìn)行了鈣吸收和利用試驗(yàn)，結(jié)果表明，CPP能促進(jìn)鈣的吸收和利用^[1]。Sato等也報(bào)道，CPP可促進(jìn)核素標(biāo)記的鈣在大鼠股骨中沉積^[2]。Tsuchita等證明，CPP可顯著抑制切除卵巢的老年雌性大鼠股骨的骨密度降低^[3]。張亞非等也通過(guò)大鼠試驗(yàn)證明，無(wú)論在低鈣飼料還是基礎(chǔ)飼料中，添加一定量的CPP后，可顯著增加斷乳大鼠對(duì)鈣的吸收率和儲(chǔ)留率，但未能證明鈣的利用率有顯著變化^[4]。本研究組用復(fù)合酶-胰酶水解酪蛋白，用選擇沉淀法從酪蛋白的酶解液中分離CPP，得到了CPP產(chǎn)品，并分析測(cè)定了其主要組分的分子結(jié)構(gòu)^[5]和體外功能指標(biāo)^[6]。本研究將通過(guò)大鼠試驗(yàn)研究該產(chǎn)品對(duì)切除卵巢后老齡雌性大鼠骨密度的影響及對(duì)骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用。

1. 材料及方法

1.1CPP及大鼠飼料

CPP是用選擇沉淀法從酪蛋白的胰酶水解液中分離得到，其中總氮、鈣及磷的含量分別為9.07%、6.00%和2.94%，水分含量為17.0%。大鼠基礎(chǔ)飼料的主要組成（%）為：小麥粉30、豆餅粉30、玉米粉30、魚(yú)粉5.0、骨粉1.5、脫脂奶粉1.6、魚(yú)肝油1.0、食鹽0.5.試驗(yàn)組飼料由基礎(chǔ)飼料添加8%的CPP制成。

1.2 試驗(yàn)大鼠卵巢切除及飼養(yǎng)

試驗(yàn)大鼠為SD品系，11m齡時(shí)自浙江實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)入。18只大鼠隨機(jī)分成3組，每只鼠分別標(biāo)記，單籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫度（20~25）℃，試驗(yàn)大鼠自由進(jìn)食基礎(chǔ)飼料和自來(lái)水。至13m齡時(shí)，對(duì)其中兩組實(shí)施卵巢切除術(shù)，另一組施行偽手術(shù)（造成同樣的創(chuàng)口，但不切除卵巢）。手術(shù)前用65mg/kg bw的硫噴妥鈉對(duì)大鼠施行麻醉，切下的卵巢分別放入裝有福爾馬林溶液的小瓶，送病理科檢驗(yàn)卵巢是否切除完整。

手術(shù)后恢復(fù)飼養(yǎng)1m，之后將一組切除卵巢的大鼠作為對(duì)照1組(Sham），飼喂基礎(chǔ)飼料。一次給入一星期的飼料（200~220g），下次補(bǔ)充飼料前對(duì)所剩飼料稱重，精確記錄每只鼠的飼料消耗量。

1.3 骨密度（BMD）和骨礦物質(zhì)含量（BMC）的測(cè)定、

測(cè)定BMD和BMC之前，先稱重，按55mg/kg bw硫噴妥鈉的劑量對(duì)大鼠實(shí)施麻醉。麻醉后將大鼠擺成匍匐狀，四肢自然伸展，用橡皮膏固定于紙上，在DEXA雙能X-線骨密度儀（美國(guó)，Norland公司）上，對(duì)鼠全身進(jìn)行掃描，掃描結(jié)束后，框取鼠全身，鼠頭部或腿部，用骨密度儀上配置的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算全身或鼠體不同部位的BMD和BMC。

1.4 磁性激素的測(cè)定

在對(duì)大鼠施行卵巢切除手術(shù)之前和手術(shù)后1m時(shí)，分別從每只大鼠尾部采集0.5ml血液，用放免試劑盒測(cè)定血液中雌二醇（E2）、黃體生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示，各組間的差異顯著性分析用DPS數(shù)據(jù)處理軟件，采用Bonferroni檢驗(yàn)法分析。

2. 結(jié)果

2.1 磁性激素的測(cè)定及卵巢病理檢驗(yàn)結(jié)果

卵巢在卵成熟前分泌雌二醇，卵巢切除后血液中雌二醇水平下降，切除卵巢后，黃體生成素和促卵泡激素在血液中的含量都將上升^[7]。從測(cè)定手術(shù)前后血液中三種雌性激素含量的變化，可以確證卵巢切除術(shù)的效果。保證最終試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。由江蘇原子醫(yī)學(xué)研究所附屬江原醫(yī)院檢驗(yàn)科完成的三種雌性激素的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)合病理科出具的檢驗(yàn)報(bào)告可以肯定，大量的卵巢均被完整切除。

Table 1 Hormines of rats before and after ovariectomy*

Before：before ovariectomy；After： after ovariectomy；* the data is the average of six rats

2.2 大鼠體重的變化

試驗(yàn)期間三組大鼠的體重變化不大，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組大鼠的體重略有上升。T組大鼠體重一直呈上升趨勢(shì)，Sham 1 和Sham 2組手術(shù)后體重一度呈下降趨勢(shì)，術(shù)后2m時(shí)，體重又開(kāi)始慢慢回升。

2.3 大鼠的骨密度（BMD）和骨礦物質(zhì)含量（BMC）

在對(duì)大鼠施行手術(shù)之后4.5m，也即用添加CPP的飼料飼喂大鼠3.5m之后，測(cè)定了其BMD和BMC。大鼠全身BMD和BMC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。手術(shù)后4.5m時(shí)，Sham 1組和Sham 2組的BMD和BMC幾乎等同，CPP組的BMD和BMC均比對(duì)照組高，統(tǒng)計(jì)分析表明，CPP組與Sham 1及Sham 2的差異均未達(dá)到顯著水平（P>0.05）。

Table 2 BMD and BMC of the whole body of rats ()

研究表明，骨質(zhì)疏松癥常按以下順序發(fā)生骨骼損耗：第一步，頜骨、牙槽骨發(fā)生骨損，引起支持牙齒的力量下降，造成牙齦松動(dòng)繼而損壞而掉牙；第二步，脊椎骨骨骼損耗，導(dǎo)致難于愈合的壓迫性骨折，使病人睡年齡的增長(zhǎng)而身高降低；第三步，長(zhǎng)骨骨損發(fā)生。因?yàn)橐陬M骨和脊椎骨有骨損時(shí)，長(zhǎng)骨的骨質(zhì)才開(kāi)始丟失，因此早期的骨質(zhì)疏松癥用X射線是難于確診的，但通過(guò)X射線照射頜骨能迅速地診斷早期的骨質(zhì)疏松癥^[8]。鑒于此，我們對(duì)大鼠的頭部及左、右腿的BMD和BMC分別進(jìn)行了就算，結(jié)果見(jiàn)表3.

Table 2 BMD and BMC of heads and legs of rats ()

Note:data in the same column not sharing same superscript are significantly different(p<0.05)

從表3中看出，CPP組頭部的BMD明顯高于Sham 1組(p<0.05)，但CPP組頭部的BMD與Sham 2之間及CPP組頭部的BMC與兩對(duì)照之間的差異均未達(dá)到顯著水平。而大鼠腿部的BMD和BMC則更未表現(xiàn)出差異。

3. 討論

據(jù)Hodgkinsin^[7]報(bào)道，單純性卵巢切除（不輔以其它引發(fā)骨質(zhì)疏松的因素），手術(shù)組骨量減少至比對(duì)照組顯著降低（顯著水平為p<0.05）需30w，即7m多。Kalu等^[9]也報(bào)道，切除卵巢的老齡大鼠，6m后，股骨和腰椎的骨密度才能顯著降低。為了模擬攝取正常膳食的絕經(jīng)婦女，本研究采用單純性卵巢切除來(lái)誘發(fā)骨質(zhì)疏松，由于時(shí)間及其它方面條件的限制，本試驗(yàn)未能繼續(xù)至單純性卵巢切除誘使骨密度顯著降低所需的時(shí)間期限（7m左右）。因此，除了CPP處理組與切除卵巢的對(duì)照組（Sham 1）的頭部骨密度差異達(dá)到顯著水平外，大鼠全身及腿部的骨密度及骨礦物質(zhì)含量與Sham 之間及Sham 1和Sham 2組之間骨密度的差異均未達(dá)到顯著水平。但由于動(dòng)物骨損的發(fā)生有前述特定的規(guī)律，第一步是發(fā)生在頭部，之后才是脊椎和長(zhǎng)骨，因此在頭部已表現(xiàn)出明顯的骨損后，將試驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行下去，腿部及全身表現(xiàn)明顯骨損的可能性很大，若能輔以低鈣飼料，則將會(huì)加快這一進(jìn)程。就目前取得的結(jié)果分析，已可以肯定CPP對(duì)延緩切除卵巢的老齡磁性大鼠骨質(zhì)丟失有一定效果。

關(guān)鍵詞：酪蛋白磷酸肽；老齡大鼠；骨密度；骨質(zhì)疏松

Key words: casein phosphopeptides(CPP); aged rats; bone mineral density(BMD); osteoporosis

參考文獻(xiàn)

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