酪蛋白磷酸肽功能性質(zhì)的體外研究

Column：Academic Achievement Time：2022-02-14

CPPs的作用效果不僅與N/P值有關(guān)，還和它們分子中氨基酸的組成和排序或磷酸基的分布有關(guān)。

馮鳳琴許時嬰王璋

(無錫輕工大學(xué)食品學(xué)院，無錫,214036)

摘要：以酪蛋白為原料，通過有控制的酶解以及離子交換和凝膠過濾技術(shù)制得N/P（摩爾比）不同的酪蛋白磷酸肽（CPPs），并對其體外阻止磷酸鈣沉淀的效果進(jìn)行了分析，測定和比較，在添加量相同時，總的趨勢是N/P較小的樣品阻止磷酸鈣沉淀形成的效果好于N/P值較大的樣品。CPPs的作用效果不僅與N/P值有關(guān)，還和它們分子中氨基酸的組成和排序或磷酸基的分布有關(guān)。

關(guān)鍵詞：酪蛋白磷酸肽，N/P值，磷酸鈣沉淀

In Vitro Study of the Function Properties of Casein Phosphopeptides(CPPs)

Feng Fengqin Xu Shiying Wang Zhang

(School of Food Science,Wuxi University of Light Industry,Wuxi,214036)

Abstract CPPs with different molar ratio of nitrogen to phosphorus(N/P) were obtained through hydrolyzing casein enzymatically,ion exchange chromatography and gel filtration chromatography.The effects of the various CPPs on ratarding the foemation of calcium phosphate precipitate were determined and compared.The results showed that CPPs with lower N/P were more effective than that with higher one.The amino acid composition and sequence of the peptides(or distribution of phosphoryls)as well as the N/P determine the function effects of CPPs.

Key Word casein phosphopeptides,N/P value,calcium phosphate precipitate

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides,簡稱CPPs），是由酪蛋白經(jīng)酶水解、分離、純化而制得的含有成簇的成簇的磷酸絲氨酰（phosphoseryl）的肽。在動物腸內(nèi)PH呈中性到弱堿性的環(huán)境下，CPPs能阻止磷酸鈣沉淀的產(chǎn)生，使溶解鈣保持在高水平，從而促進(jìn)鈣的吸收和利用^[1,2]。CPPs的生理活性由其分子中氨基酸的組成和排序（或磷酸基的分布）決定。CPPs的N/P摩爾比可反映CPPs的純度和磷酸基密度，N/P較低，則純度或磷酸基密度較高。純度不同或磷酸基密度不同的CPPs結(jié)合鈣的能力也不同。本研究通過控制酪蛋白的酶解程度及離子交換色譜和凝膠過濾色譜制得的N/P不同的CPPs，并對其體外結(jié)合鈣的能力進(jìn)行分析，測定和比較。

1. 材料與方法

1.1 不同N/P的CPPs樣品的制備

向15%的酪蛋白溶液中加入胰酶（蘇州吳縣西由生物制品廠），于37℃、PH8.0反應(yīng)至DH（水解度）達(dá)8%以上，用HCl調(diào)PH至4.5，離心除去沉淀，在上清液中加入氯化鈣和乙醇，使其終濃度分別為1%（w/v）和50%，離心所得沉淀經(jīng)冷凍干燥得樣品F，真空干燥沉淀所得樣品為A。

在胰酶作用結(jié)束后，加入微生物中性蛋白酶（無錫酶制劑廠）繼續(xù)作用，使第二次酶解的DH達(dá)2%以上，用HCl調(diào)PH至4.5，離心后棄沉淀，在上清液中加入氯化鈣和乙醇，使其終濃度分別為1%（w/v）和50%，離心所得沉淀經(jīng)冷凍干燥即為樣品B。

1.2 樣品A和B的純化

樣品A和B中仍然含有一些非磷酸肽（non-phosphopeptides,簡稱NPPs），NPPs的去除采用離子交換法。采用的離子交換劑為大孔強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂D290（南開大學(xué)化工廠生產(chǎn)），離子交換柱規(guī)格為50×5.5（cm）。首先將樹脂由Cl型轉(zhuǎn)為Ac型，用冰乙酸將6%的樣品A或B的稀溶液的PH調(diào)至5.5，以300ml/h的速度將樣品上柱。上樣后，用去離子水洗去未被吸附的物質(zhì)，再用0.2NHCl將被吸附的CPPs洗脫下來。洗脫液用NaOH中和后，干燥即得樣品A’或B’。

1.3 凝膠過濾色譜

經(jīng)過離子交換色譜純化后的樣品A’和B’組成仍很復(fù)雜，還可根據(jù)其性質(zhì)分成不同的組。用凝膠過濾色譜可將CPPs再按分子量大小進(jìn)行分組，所采用的凝膠為SephadexG-25，凝膠柱規(guī)格為100×2.6（cm），洗脫液為0.01N的HCl。上樣前調(diào)節(jié)樣品液的PH至2.0，若有渾濁需過濾除去沉淀，洗脫速度為40ml/h。

1.4 總氮、總磷的測定

總氮用凱氏定氮法測定?？偭椎臏y定參考Morrison的快速微量定磷法^[3]。將干燥至恒重的分析純KH₂PO₄配成含磷10?/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于10ml硬質(zhì)刻度試管中，用去離子水補(bǔ)加至1.0ml，置于105~110℃烘箱中烘干，加入0.3ml濃H₂SO₄，于電爐上加熱至沸，稍冷后加入一滴H₂O₂，繼續(xù)加熱。滴加H₂O₂的過程可重復(fù)進(jìn)行直至試管中溶液無色、澄清為止。繼續(xù)加熱5min，冷卻后加水至3ml，加入16.5%的NaSO₃0.1ml，搖勻后，加入1ml12%的鉬酸銨溶液，立即搖勻，再加入0.5ml濃度為20㎎/ml抗壞血酸溶液，混勻后，在沸水浴中加熱10min，冷卻后，用去離子水定容至5.0ml（試管刻度需預(yù)先標(biāo)定），于822nm比色，以含磷量為橫坐標(biāo)，OD822值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品溶液稀釋至含磷1~10?/ml，按上法顯色，以1.0ml去離子水代替樣品液作為空白。

1.5 不同N/P的CPPs阻止磷酸鈣沉淀形成的效果比較

CPPs阻止磷酸鈣沉淀形成的效果用PH-Atat法檢測^[4]。在反應(yīng)器中加入適量的NaH₂PO₄和CPPs使兩者在500ml反應(yīng)體系中終濃度分別為0.008mol/L和0.0或0.1或0.2g/l。溶液保溫至25℃后加入CaCl₂，使之終濃度達(dá)0.008mol/L。此時立即用0.1N NaOH將反應(yīng)體系PH調(diào)至7.2并不斷滴加0.1N NaOH，使PH保持在7.2。從調(diào)節(jié)PH即開始計時，PH調(diào)至7.2約需2min。從2min開始連續(xù)記錄0.1N NaOH的消耗量。以時間為橫坐標(biāo)，0.1N NaOH的消耗量為縱坐標(biāo)作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子交換色譜

圖1為一典型的離子交換色譜圖，在前述色譜條件下對CPPs樣品進(jìn)行純化，得到兩個峰，經(jīng)檢測第一個峰不含磷，即為NPPs，第二個峰即為得到了純化的CPPs。

2.2 凝膠過濾色譜

經(jīng)離子交換色譜純化后得到的樣品A’和B’再經(jīng)凝膠過濾都出現(xiàn)兩個峰，如圖2所示。從樣品A’得到樣品A’1和A’2，從樣品B’得到樣品B’1和B’2。分別收集每個峰并測定其總氮和總磷含量。各樣品的N/P值見表1.其中明治CPP-Ⅲ為日本明治株式會社會社提供的樣品。CPP（g）為廣州輕工研究所提供的樣品。

表 1 各樣品的N/P值

樣品	A*	B	A’	B’	A’1	A’2	B’1	B’2	時治CPP-Ⅲ	CPP（g）	F
N/P	6.83	5.82	5.36	4.88	5.17	3.13	4.86	4.51	9.6	7.6	7.47

注：為在真空干燥過程中酪蛋白磷酸肽受熱凝結(jié)，同時將包含的溶液擠出。為了加快干燥過程曾除去這部分溶液，此溶液中含較高的NPP，因此樣品A*的N/P低于用冷凍干燥所得的樣品F的N/P。

2.3 不同N/P值的CPPs阻止磷酸鈣沉淀形成的效果

在有CaCl₂和Ca（H₂PO₄）₂存在的溶液體系中，Ca₃（PO₄）₂的自發(fā)生成涉及下列反應(yīng)^[4]：

（1）Ca（H₂PO₄）₂→CaHPO₄^-+H⁺

（2）3CaHPO₄→Ca₃（PO₄）₂+HPO₄²^-+2H⁺

兩步反應(yīng)都有H⁺釋放出來，所以可用前述PH-Stat法間接檢測CPPs對這些反應(yīng)的影響。為使反應(yīng)體系的PH保持在一指定值（PH7.2）而加入NaOH的速度（NaOH的加入量隨時間而增加）較低時，可認(rèn)為反應(yīng)體系中CPPs樣品阻止磷酸鈣沉淀形成的效果較好。

圖3（1-5） CPPs阻止磷酸鈣沉淀形成的效果

圖3（1）為不添加CPPs和添加不同量的CPPs對磷酸鈣沉淀過程的影響。不添加CPPs時，磷酸鈣沉淀迅速形成，添加0.1g/l的CPP F幾乎可以完全阻止磷酸鈣沉淀形成。

圖3（2）是對N/P不同的CPPs阻止磷酸鈣沉淀形成的效果的比較。CPP A、B、F與對照相比都顯著地推遲了磷酸鈣沉淀的形成，N/P較小的A和B樣品比N/P較大的F樣品效果更好。

圖3（3）比較了本實驗室制備的CPPA、日本明治CPP-Ⅲ和CPP（g）的效果。CPPA阻止沉淀形成的效果最好，其次是CPP（g），相比之下，明治CPP-Ⅲ的效果最差，但即使效果最差的CPP-Ⅲ也使沉淀過程推遲了5~10min。

圖3（4）是樣品A和B精制前后效果的比較。經(jīng)離子交換純化后樣品A和B的N/P下降1~1.5.純化后的樣品A’和B’阻止磷酸鈣沉淀形成的效果顯著增強(qiáng)，A’可使沉淀的大量形成延遲至30~40min，而B’使沉淀的大量形成延遲至更晚，直至40~45min是NaOH消耗量才快速上升。

圖3（5）比較了通過凝膠過濾得到的各部分CPPs的效果。A’1和B’1對磷酸鈣沉淀形成的推遲作用都很強(qiáng)，兩者相比，N/P較小的B’1效果尤其強(qiáng)，而A’2和B’2對推遲磷酸鈣沉淀的形成也都有一定作用，A’2使沉淀的形成由對照的5~10min推遲至15~25min，B’2則更遲至20~30min。

由以上分析可知，對CPPs制品而言，添加量相同時，總的趨勢是N/P值較小的樣品阻止磷酸鈣沉淀形成的效果好于N/P值較大的樣品。對于從凝膠過濾得到的部分，分子量較大的A’1和B’1之間也有上述趨勢。這似乎可以說明，CPPs的效果與CPPs制品內(nèi)磷酸基的密度有關(guān)，磷酸基密度較大，則效果較強(qiáng)。這一實驗結(jié)果與Sato等^[5]以及Berrocal等^[4]的實驗結(jié)果是一致的。值得注意的是N/P值較小的A’2和B’2的效果卻比N/P值較大的A’1和B’1差得多；A’2和B’2比較，A’2比B’2的N/P值小得多，但A’2的效果卻比B’2差。這一結(jié)果與Mykkanen等的實驗結(jié)果有類似之處^[6]。由此推知，CPPs的作用效果不僅和磷酸基的密度有關(guān)，還與CPPs的分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。CPPs中氨基酸組成和排序不僅決定磷酸基的密度而且還決定磷酸基在肽鏈中的分布。CPPs的分子結(jié)構(gòu)與其功能性質(zhì)的關(guān)系還有待實驗結(jié)果的進(jìn)一步證實。我們深信這方面的研究工作將為生產(chǎn)結(jié)構(gòu)更為合理的CPPs產(chǎn)品提供理論依據(jù)。