Effsect of Casein Phosphopeptides on the Bone Mineral Density in Aged Ovariectomized Rat

馮鳳琴¹，王博誠²，許時嬰³，王璋³，金堅²

（¹浙江大學食品科學與營養(yǎng)系，杭州 310029；²江蘇源自醫(yī)學研究所，無錫 214036；³江南大學食品學院，無錫 214036）

FENG Fengqin¹,WANG Bo-cheng²,XU Shi-ying³,WANG Zhang³,JIN Jian²

(¹Department of Food Science and Nutrition,Zhejiang University,Hangzhou 310029;

²Jiangsu Institute of Nuclear Medicine,Wixi 214036;

³School of Food Science,Wuxi University of Light Industry,Wuxi 214036,China)

酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides,簡稱CPP)是以牛乳酪蛋白為原料,經單一酶或復合酶水解,再經分離純化而得到的含有成簇的磷酸絲氨?；亩嚯?。Mykkanen等在正常雞和佝僂病雞上進行了鈣吸收和利用試驗，結果表明，CPP能促進鈣的吸收和利用^[1]。Sato等也報道，CPP可促進核素標記的鈣在大鼠股骨中沉積^[2]。Tsuchita等證明，CPP可顯著抑制切除卵巢的老年雌性大鼠股骨的骨密度降低^[3]。張亞非等也通過大鼠試驗證明，無論在低鈣飼料還是基礎飼料中，添加一定量的CPP后，可顯著增加斷乳大鼠對鈣的吸收率和儲留率，但未能證明鈣的利用率有顯著變化^[4]。本研究組用復合酶-胰酶水解酪蛋白，用選擇沉淀法從酪蛋白的酶解液中分離CPP，得到了CPP產品，并分析測定了其主要組分的分子結構^[5]和體外功能指標^[6]。本研究將通過大鼠試驗研究該產品對切除卵巢后老齡雌性大鼠骨密度的影響及對骨質疏松的預防作用。

1. 材料及方法

1.1CPP及大鼠飼料

CPP是用選擇沉淀法從酪蛋白的胰酶水解液中分離得到，其中總氮、鈣及磷的含量分別為9.07%、6.00%和2.94%，水分含量為17.0%。大鼠基礎飼料的主要組成（%）為：小麥粉30、豆餅粉30、玉米粉30、魚粉5.0、骨粉1.5、脫脂奶粉1.6、魚肝油1.0、食鹽0.5.試驗組飼料由基礎飼料添加8%的CPP制成。

1.2 試驗大鼠卵巢切除及飼養(yǎng)

試驗大鼠為SD品系，11m齡時自浙江實驗動物中心購入。18只大鼠隨機分成3組，每只鼠分別標記，單籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫度（20~25）℃，試驗大鼠自由進食基礎飼料和自來水。至13m齡時，對其中兩組實施卵巢切除術，另一組施行偽手術（造成同樣的創(chuàng)口，但不切除卵巢）。手術前用65mg/kg bw的硫噴妥鈉對大鼠施行麻醉，切下的卵巢分別放入裝有福爾馬林溶液的小瓶，送病理科檢驗卵巢是否切除完整。

手術后恢復飼養(yǎng)1m，之后將一組切除卵巢的大鼠作為對照1組(Sham），飼喂基礎飼料。一次給入一星期的飼料（200~220g），下次補充飼料前對所剩飼料稱重，精確記錄每只鼠的飼料消耗量。

1.3 骨密度（BMD）和骨礦物質含量（BMC）的測定、

測定BMD和BMC之前，先稱重，按55mg/kg bw硫噴妥鈉的劑量對大鼠實施麻醉。麻醉后將大鼠擺成匍匐狀，四肢自然伸展，用橡皮膏固定于紙上，在DEXA雙能X-線骨密度儀（美國，Norland公司）上，對鼠全身進行掃描，掃描結束后，框取鼠全身，鼠頭部或腿部，用骨密度儀上配置的數(shù)據處理系統(tǒng)計算全身或鼠體不同部位的BMD和BMC。

1.4 磁性激素的測定

在對大鼠施行卵巢切除手術之前和手術后1m時，分別從每只大鼠尾部采集0.5ml血液，用放免試劑盒測定血液中雌二醇（E2）、黃體生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）的含量。

1.5 統(tǒng)計分析

實驗結果用表示，各組間的差異顯著性分析用DPS數(shù)據處理軟件，采用Bonferroni檢驗法分析。

2. 結果

2.1 磁性激素的測定及卵巢病理檢驗結果

卵巢在卵成熟前分泌雌二醇，卵巢切除后血液中雌二醇水平下降，切除卵巢后，黃體生成素和促卵泡激素在血液中的含量都將上升^[7]。從測定手術前后血液中三種雌性激素含量的變化，可以確證卵巢切除術的效果。保證最終試驗結果的可靠性。由江蘇原子醫(yī)學研究所附屬江原醫(yī)院檢驗科完成的三種雌性激素的測定，結果見表1，結合病理科出具的檢驗報告可以肯定，大量的卵巢均被完整切除。

Table 1 Hormines of rats before and after ovariectomy*

Before：before ovariectomy；After： after ovariectomy；* the data is the average of six rats

2.2 大鼠體重的變化

試驗期間三組大鼠的體重變化不大，至試驗結束時，各組大鼠的體重略有上升。T組大鼠體重一直呈上升趨勢，Sham 1 和Sham 2組手術后體重一度呈下降趨勢，術后2m時，體重又開始慢慢回升。

2.3 大鼠的骨密度（BMD）和骨礦物質含量（BMC）

在對大鼠施行手術之后4.5m，也即用添加CPP的飼料飼喂大鼠3.5m之后，測定了其BMD和BMC。大鼠全身BMD和BMC測定結果見表2。手術后4.5m時，Sham 1組和Sham 2組的BMD和BMC幾乎等同，CPP組的BMD和BMC均比對照組高，統(tǒng)計分析表明，CPP組與Sham 1及Sham 2的差異均未達到顯著水平（P>0.05）。

Table 2 BMD and BMC of the whole body of rats ()

研究表明，骨質疏松癥常按以下順序發(fā)生骨骼損耗：第一步，頜骨、牙槽骨發(fā)生骨損，引起支持牙齒的力量下降，造成牙齦松動繼而損壞而掉牙；第二步，脊椎骨骨骼損耗，導致難于愈合的壓迫性骨折，使病人睡年齡的增長而身高降低；第三步，長骨骨損發(fā)生。因為要在頜骨和脊椎骨有骨損時，長骨的骨質才開始丟失，因此早期的骨質疏松癥用X射線是難于確診的，但通過X射線照射頜骨能迅速地診斷早期的骨質疏松癥^[8]。鑒于此，我們對大鼠的頭部及左、右腿的BMD和BMC分別進行了就算，結果見表3.

Table 2 BMD and BMC of heads and legs of rats ()

Note:data in the same column not sharing same superscript are significantly different(p<0.05)

從表3中看出，CPP組頭部的BMD明顯高于Sham 1組(p<0.05)，但CPP組頭部的BMD與Sham 2之間及CPP組頭部的BMC與兩對照之間的差異均未達到顯著水平。而大鼠腿部的BMD和BMC則更未表現(xiàn)出差異。

3. 討論

據Hodgkinsin^[7]報道，單純性卵巢切除（不輔以其它引發(fā)骨質疏松的因素），手術組骨量減少至比對照組顯著降低（顯著水平為p<0.05）需30w，即7m多。Kalu等^[9]也報道，切除卵巢的老齡大鼠，6m后，股骨和腰椎的骨密度才能顯著降低。為了模擬攝取正常膳食的絕經婦女，本研究采用單純性卵巢切除來誘發(fā)骨質疏松，由于時間及其它方面條件的限制，本試驗未能繼續(xù)至單純性卵巢切除誘使骨密度顯著降低所需的時間期限（7m左右）。因此，除了CPP處理組與切除卵巢的對照組（Sham 1）的頭部骨密度差異達到顯著水平外，大鼠全身及腿部的骨密度及骨礦物質含量與Sham 之間及Sham 1和Sham 2組之間骨密度的差異均未達到顯著水平。但由于動物骨損的發(fā)生有前述特定的規(guī)律，第一步是發(fā)生在頭部，之后才是脊椎和長骨，因此在頭部已表現(xiàn)出明顯的骨損后，將試驗持續(xù)進行下去，腿部及全身表現(xiàn)明顯骨損的可能性很大，若能輔以低鈣飼料，則將會加快這一進程。就目前取得的結果分析，已可以肯定CPP對延緩切除卵巢的老齡磁性大鼠骨質丟失有一定效果。

關鍵詞：酪蛋白磷酸肽；老齡大鼠；骨密度；骨質疏松

Key words: casein phosphopeptides(CPP); aged rats; bone mineral density(BMD); osteoporosis

參考文獻

[1] Mykkanen HM, Wasserman RH.Enhanced absorption of calcium by casein phosphopeptides in rachitic and normal chicks[J]. J Nut.1980,110;2141-2148.

[2] Sato R,Noguchi T,Natio H.Casein phosphopeptide enhance calcium absorption from the ligated segment of rat small intestine[J].J Nutr Sci Vitaminol,1986,32:67-76.

[3] Truchita H,Goto T,Shimizu T,et al,Dietary casein phosphopeptides prevent bone loss in aged ovariectomized rats[J].J Nutr Sci,1996,126:86-93.

[4] 張亞非，周羽并，吳鳳蘭，等，酪蛋白磷酸肽（CPP）對大鼠鈣吸收利用的影響[J].營養(yǎng)學報，1994，16:73-77

[5] 馮鳳琴，王博誠，倪莉，等，酪蛋白磷酸肽分子結構的鑒定[J].無錫輕大學學報，1999,18:33-37.

[6] 馮鳳琴，許時嬰，王璋，低N/P酪蛋白磷酸肽的生產制備及功能性質的研究[J].中國食品學報，1998,2:1-5

[7] Hodgkinson A,Aaron JE,Horsman A,et al.Effect of oophorectomy and calcium deprivation in bone mass in the rat[J].Clin Sci Mol Med,1978,54:439-446.

[8] [美】AH恩斯明格.ME恩斯明格，JE康蘭德，等，疾病與飲食[M].北京：農業(yè)出版社，1989.176-177.

[9] Kalu DK,Liu CC,Hardin R,et al.The afed rat model of ovarian hormone deficiency bone loss[J].Endocrinology,1989,124:7-16.