王玉瑩¹ ，陳錫威² ，馮鳳琴^3*，宋俊梅^1*

1. 齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（濟(jì)南 250353）；2. 杭州康源食品科技有限公司（杭州 310000）；

3. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院（杭州 310058）

摘 要 酪蛋白磷酸肽是一種含有磷酸絲氨酸的生物活性肽, 具有促進(jìn)人體對(duì)鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)的吸收以及預(yù)防齲齒等多種生物學(xué)功能。主要介紹了酪蛋白磷酸肽的生理功能和應(yīng)用, 并對(duì)其檢測(cè)方法進(jìn)行了簡(jiǎn)要的總結(jié)。

關(guān)鍵詞 酪蛋白磷酸肽; 生理功能; 應(yīng)用; 檢測(cè)

Research Progress in Casein Phosphopeptides

Wang Yu-ying¹ , Chen Xi-wei² , Feng Feng-qin^3*, Song Jun-mei^1*

1. School of Food and Bioengineering, Qilu University of Technology (Jinan 250353);

2. Hangzhou Kangyuan Food Science and Technology Ltd (Hangzhou 310000);

3. School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University (Hangzhou 310058)

Abstract Casein phosphopeptides, a kind of bioactive peptides with phosphoserine cluster, have many biological functions such as promoting the absorption of calcium, iron, zinc and other divalent minerals in human body, preventing caries and so on. This article mainly introduced the physiological function and application of casein phosphopeptides, and brieflfl y summarized the detection methods of CPPs.

Keywords casein phosphopeptides; physiological function; application; detection

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）是以牛奶酪蛋白為原料，經(jīng)過(guò)單一或復(fù)合蛋白酶的水解，通過(guò)生物技術(shù)制得的具有生物活性的多肽。在堿性條件下，CPPs可防止鈣、鐵等離子的沉淀，從而促進(jìn)其吸收，因此CPPs被稱(chēng)為“礦質(zhì)載體”。隨著鈣強(qiáng)化劑的推廣應(yīng)用，CPPs在日本、東南亞、歐洲、澳大利亞等地已被廣泛應(yīng)用于鈣強(qiáng)化乳制品、果汁飲料、蛋白飲料和速溶飲品、運(yùn)動(dòng)食品、糖果、營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑以及防齲齒口香糖中。我國(guó)現(xiàn)在已經(jīng)將CPPs作為食品添加劑廣泛用于嬰幼兒奶粉、鈣鐵鋅等礦物質(zhì)補(bǔ)充食品及營(yíng)養(yǎng)保健食品中。

1 CPPs的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

1.1 CPPs的結(jié)構(gòu)

CPPs有α和β 2種構(gòu)型，分別由α-酪蛋白和β-酪蛋白水解分離純化生成，其主要功能區(qū)是αS1(59-79)5P和β(1-28)4P，活性中心是成串的磷酸絲氨酸和谷氨酸簇，其結(jié)構(gòu)可表示為-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-，現(xiàn)已證明該核心結(jié)構(gòu)是發(fā)揮 CPPs生物活性必不可少的部分。CPPs分布于αS1-酪蛋白和β-酪蛋白等牛乳蛋白的不同區(qū)域，所以不同的酶作用于酪蛋白生成的CPPs的分子量不同，而且，動(dòng)物體內(nèi)分離到的CPPs分子鏈比體外水解產(chǎn)物短，因此，其磷酸解離常數(shù)也不同。

1.2 CPPs的物理性質(zhì)

CPPs產(chǎn)品具有良好的溶解性，在pH 2.0～10.0內(nèi)，其溶解性除在pH 4.0約為90％外，其它均高于90％，且溶解性隨pH的增高而增大。CPPs產(chǎn)品較酪蛋白具有更好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。CPPs產(chǎn)品乳化力較好，其乳化力較酪蛋白下降了約20%，乳化性下降了2.89%，乳化穩(wěn)定性下降了1.45倍。在CPPs產(chǎn)品加工時(shí)可以進(jìn)行有效的殺菌處理，在100 ℃條件下殺菌30 min不會(huì)對(duì)產(chǎn)品外觀造成改變。CPPs作為鈣、鐵吸收促進(jìn)劑，Ca2+的存在不會(huì)影響產(chǎn)品的色澤^[1]。

2 CPPs的生理功能

2.1 促進(jìn)礦物元素的吸收

國(guó)內(nèi)外針對(duì)CPPs促進(jìn)鈣吸收的研究比較多，其中，促進(jìn)鈣吸收的機(jī)理已經(jīng)日趨明朗化。鈣在腸道中必須以離子的形式才能被吸收，在小腸前段維生素D作為鈣吸收促進(jìn)劑可加強(qiáng)鈣在小腸前段的主動(dòng)吸收。而在小腸后段鈣的吸收形式是被動(dòng)擴(kuò)散，吸收效率取決于小腸內(nèi)鈣離子的游離濃度，但是鈣離子在中性和弱堿性環(huán)境下易與酸根離子形成不溶性鹽而流失^[2]。大量的研究表明，CPPs帶有高濃度的負(fù)電荷，既可以抵抗消化道中各種酶的水解，又可以與鈣結(jié)合成可溶物，從而有效地防止鈣在小腸中性或偏堿性環(huán)境中形成磷酸鈣沉淀，同時(shí)它還可以有效地增加鈣在體內(nèi)的滯留時(shí)間，該結(jié)合物在被腸壁細(xì)胞吸收后才把鈣釋放出來(lái)。近年來(lái)，關(guān)于CPPs促進(jìn)鈣吸收的研究主要集中影響其結(jié)合能力的因素方面，如CPPs/Ca、N/P、CPPs分子結(jié)構(gòu)等。

1950年，Melland er^[3]首次從酪蛋白的胰蛋白酶水解物中分離得到CPPs，并且證明，CPPs可增加鈣的生物利用率，在缺乏維生素D的情況下，患有佝僂病的小孩服用酪蛋白的胰酶消化液可強(qiáng)化骨骼的鈣化。Lee等^[4]進(jìn)一步研究證明CPPs可增加大鼠小腸末端可溶性鈣的含量。Sato^[5]等報(bào)道，當(dāng)老鼠飼料中含有CPPs或酪蛋白時(shí)，將會(huì)增加其大腿組織中放射性標(biāo)記的鈣含量。此外，CPPs/Ca會(huì)影響鈣的吸收。Daniela等試驗(yàn)結(jié)果表明，CPPs與Ca比例為0.37時(shí)對(duì)提高礦質(zhì)元素運(yùn)輸是最有效的。Erba^[6]研究發(fā)現(xiàn)CPPs對(duì)大鼠遠(yuǎn)端小腸鈣的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的積極作用取決于CPPs與Ca在腸腔內(nèi)的相對(duì)量。在他的研究中，CPPs/Ca=15時(shí)對(duì)礦物轉(zhuǎn)運(yùn)最有效。

國(guó)內(nèi)對(duì)于酪蛋白磷酸肽的研究起步較晚，馮鳳琴等^[7~8]探討CPPs的N/P、分子大小與結(jié)合鈣的能力之間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)N/P較小，CPPs制品中分子量較小部分所占的比例較大，則結(jié)合鈣的能力較強(qiáng)。隨后又證明CPPs作用效果不僅與N/P有關(guān)，還和分子中氨基酸組成和順序或磷酸基分布有關(guān)。生慶海等^[9]研究認(rèn)為CPPs/Ca值為4時(shí)能顯著促進(jìn)大鼠鈣的吸收和利用，提高股骨的骨鈣含量，增加骨密度。Zong等^[10]利用6種合成磷酸肽（SPP）和酪蛋白磷酸肽（CPPs）研究磷酸肽分子結(jié)構(gòu)與其結(jié)合鈣特性之間的關(guān)系，研究表明，在模擬腸道環(huán)境中，磷酸絲氨酸殘基的數(shù)量和位置是結(jié)合鈣活性的重要因素，含有2個(gè)不連續(xù)磷酸絲氨酸的磷酸肽——SPP4是所有試驗(yàn)的磷酸肽中鈣吸附效率最高的。

此外，CPPs還能促進(jìn)動(dòng)物對(duì)其它礦物元素的吸收和利用。Andrew等研究表明，水解產(chǎn)物CPPs由于暴露出的Ser-P能阻止Fe的沉淀，從而提高Fe的生物利用率，并且發(fā)現(xiàn)Fe的利用率和體內(nèi)的堿性磷脂酶有關(guān)。對(duì)大鼠試驗(yàn)表明，在含肌醇六磷酸飼料中添加CPPs，Zn的吸收利用率提高約10％～50％^[11]。P. Etcheverry等^[12]綜合研究了CPPs對(duì)鈣、鐵、鋅、硒等的生物利用率。另外，CPPs對(duì)提鎂的生物利用率也有一定作用，還可作為鐵、錳、銅、硒的載體，是一種良好的金屬結(jié)合肽。

2.2 防止齲齒

齲齒表現(xiàn)為無(wú)機(jī)質(zhì)的脫礦和有機(jī)質(zhì)的分解，是口腔主要的常見(jiàn)病，其特點(diǎn)是發(fā)病率高，分布廣，世界衛(wèi)生組織已將其與癌腫和心血管疾病并列為人類(lèi)3大重點(diǎn)防治疾病。而CPPs可用于防止和治療齲齒，近年來(lái)，對(duì)于CPPs的研究主要集中在這一功能。研究表明，CPPs在溶液中能與非結(jié)晶型磷酸鈣結(jié)合成復(fù)合體，即酪蛋白磷酸肽鈣磷復(fù)合體（ casein phosphopeptides-amorphous calcium phosphate，CPP ACP）。CPPs作為一種含多個(gè)磷酸絲氨酸的蛋白質(zhì)，既有穩(wěn)定鈣磷離子的作用，又有促進(jìn)磷酸鈣相分離的作用。而非結(jié)晶型磷酸鈣（ACP）是從牛奶中提取的具有生物活性的鈣離子和磷酸鹽離子，能被牙面吸收。1997年，Reynolds^[13]已經(jīng)證明CPP-ACP是可溶性復(fù)合物，可以附著在齲損處，維持高水平的鈣離子濃度，促使鈣離子進(jìn)入齲損區(qū)，促進(jìn)早期齲損再礦化，從而有效地防止牙蝕細(xì)菌的侵蝕，起到抗齲齒的作用。Cross等^[14]的研究也證明早期牙釉質(zhì)損傷的修復(fù)就是源于這一復(fù)合體。他們認(rèn)為CPPs形成磷酸鈣運(yùn)載工具，這阻止了牙釉質(zhì)去礦化并促進(jìn)了再礦化。Yamaguchi等^[15]通過(guò)超聲波脈沖在無(wú)破壞情況下測(cè)定牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)的去礦化和再礦化，得出高濃度CPP-ACP中含有的無(wú)機(jī)成分可增強(qiáng)牙釉質(zhì)再礦化的結(jié)論。喻明玲等^[16]用顯微硬度測(cè)量法研究CPPACP對(duì)碳酸飲料酸蝕后的牙釉質(zhì)的再礦化作用，研究表明，CPP-ACP能促進(jìn)鈣鹽沉積于脫礦釉質(zhì)表面而提高酸蝕牙釉質(zhì)的顯微硬度，顯著促進(jìn)酸蝕釉質(zhì)再礦化。

用CPPs制成的抗齲齒添加劑是目前唯一不同于氟化物的添加劑。

2.3 增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力

CPPs結(jié)構(gòu)中起免疫調(diào)節(jié)作用的部位是含有3個(gè)氨基酸殘基的小肽，且N端和C端分別是一個(gè)磷酸絲氨酸殘基，即SerP-X-SerP結(jié)構(gòu)^[2]。CPPs通過(guò)Ser-P鈣離子形成復(fù)合物阻止磷酸鈣沉淀的產(chǎn)生從而促進(jìn)鈣離子的吸收，而鈣離子能夠通過(guò)改變脂分子功能來(lái)幫助T淋巴細(xì)胞活化，提高其對(duì)外來(lái)抗原的敏感性，從而幫助機(jī)體清除病原體提高免疫力。CPPs還通過(guò)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞因子的水平來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫功能。

2.4 其它生理功能

CPPs還具有促進(jìn)動(dòng)物體外受精和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等生理功能。目前，CPPs促進(jìn)動(dòng)物體外受精的作用機(jī)理尚不十分清楚，可能與溶解狀態(tài)鈣離子介導(dǎo)的精卵細(xì)胞融合有關(guān)，也可能與谷氨酸的游離羧基有關(guān)。酪蛋白磷酸肽的促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用已經(jīng)在人腸上皮腺瘤細(xì)胞HT-29細(xì)胞、Caco細(xì)胞、白血病細(xì)胞HL-60以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞PC12等細(xì)胞模型中得到證明。

3 CPPs的應(yīng)用

CPPs是以從天然牛乳中提取的酪蛋白為原料水解分離得到的功能性食品因子，因此不存在安全問(wèn)題。謝瑋等^[17]進(jìn)行的安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果表明：聚烯烴成核劑的小鼠急性毒理試驗(yàn)，根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，CPPs屬實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)（Ames試驗(yàn)），小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)說(shuō)明該物質(zhì)不具遺傳毒性作用。因此在食品中添加該物質(zhì)是安全可靠的。

3.1 CPPs在食品中的應(yīng)用

目前在國(guó)外市場(chǎng)上已有含CPPs的許多適用于兒童、老人、孕婦等不同人群的各種保健食品。日本某公司推出的一種鐵骨飲料，就是以含促進(jìn)鈣吸收的CPPs為其主要的成分；還有另外幾家日本的食品公司也推出了添加CPPs的餅干；丹麥也于1991年實(shí)現(xiàn)了CPPs的商品化。此外，美國(guó)、德國(guó)、法國(guó)等國(guó)家均進(jìn)行了積極的研究。90年代，我國(guó)的廣州輕化所開(kāi)始進(jìn)行CPPs的研究，現(xiàn)已通過(guò)技術(shù)鑒定，并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。近年來(lái)，中國(guó)的2家企業(yè)已經(jīng)將CPPs作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到3段幼兒配方乳粉中。

商品CPPs在5 ℃和25 ℃保存2年后，其防止鈣沉淀能力指標(biāo)基本沒(méi)有變化。在酸化條件下，CPPs溶解經(jīng)受120 ℃/15 min處理，功能指標(biāo)仍達(dá)95％以上，說(shuō)明CPPs能完全滿(mǎn)足嚴(yán)格的超高溫瞬時(shí)滅菌（UHT）加工要求，在酸性條件下更為穩(wěn)定。在堿性條件下，穩(wěn)定性較差，隨受熱溫度提高和受熱時(shí)間延長(zhǎng)，脫磷酸基反應(yīng)會(huì)加劇，CPPs的功能會(huì)受到影響。在一般使用條件下，CPPs的結(jié)構(gòu)和功能都是穩(wěn)定的。

徐曼^[18]等研究了食品加工過(guò)程中不同的因素對(duì)CPPs持鈣能力的影響，結(jié)果表明，短時(shí)高溫加熱未對(duì)CPPs的持鈣能力造成太大影響；葡萄糖有加速磷酸鈣沉淀的作用，葡萄糖濃度與加速沉淀的關(guān)系總體趨勢(shì)為先減小后增大；添加淀粉可使磷酸鈣沉淀形成的時(shí)間推遲5 min~10 min；添加苯甲酸鈉可使磷酸鈣沉淀時(shí)間推遲10 min左右；添加檸檬酸可使磷酸鈣沉淀的時(shí)間大大推遲。李書(shū)國(guó)^[19]在制備酸豆乳飲料的工藝中，添加了酪蛋白磷酸肽，使產(chǎn)品更富有營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，同時(shí)口感和風(fēng)味更佳。胡志和^[20]在研究通過(guò)食品加工條件對(duì)CPPs在pH 8.0時(shí)延緩磷酸鈣沉淀形成能力的影響中表明，CPPs最好應(yīng)用于含蛋白質(zhì)高、碳水化合物低的食品中。趙祥忠^[21]對(duì)保健雪米餅的研制中加入了酪蛋白磷酸肽，提高了鈣的吸收利用率，使強(qiáng)化后的產(chǎn)品品質(zhì)有了提高；CPPs在飲料中的應(yīng)用顯示出其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，可保持鈣、鐵在飲料中的穩(wěn)定性，有助于形成良好的風(fēng)味。

因此，將CPPs作為一種功能性食品基料，應(yīng)用于烘焙食品、甜點(diǎn)、冷凍食品、果子、乳酸菌飲料、果汁飲料等食品中，對(duì)提高人民生活質(zhì)量和健康水平有著廣闊的市場(chǎng)前景和社會(huì)效益。

3.2 CPPs在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用

CPPs能顯著提高仔豬血清中的IgG、IgA、IgM等抗體水平，從而增強(qiáng)了仔豬的免疫力。周根來(lái)等^[22]研究表明酪蛋白磷酸肽對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，添加0.3% CPPs對(duì)仔豬日增重和料肉比的影響較明顯。斷奶仔豬日糧中添加0.3%酪蛋白磷酸肽能提高仔豬的免疫功能，對(duì)血清免疫球蛋白IgA、IgG和外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響顯著（p＜0.05）。

CPPs可以促進(jìn)蛋雞對(duì)鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)的吸收，增強(qiáng)了蛋雞的體質(zhì)，減少了蛋雞腿病的發(fā)生，提高了蛋殼的強(qiáng)度，從而降低了產(chǎn)蛋雞的破蛋率。Ashida等^[23]試驗(yàn)表明，在正常鈣水平的日糧中添加CPPs可增強(qiáng)蛋雞骨骼的強(qiáng)度，在低鈣日糧中添加0.5% ～1.0%的CPPs可改善蛋殼的品質(zhì)。李如蘭等^[24]在0～6周齡肉仔雞基礎(chǔ)日糧中添加0.25%～1.00%的酪蛋白磷酸肽均能不同程度地提高肉仔雞平均日增重，降低料重比，其中以添加0.50%時(shí)的經(jīng)濟(jì)效益最好，研究表明，在日糧中添加酪蛋白磷酸肽能夠明顯改善肉仔雞的生產(chǎn)性能。

CPPs還可以顯著提高種畜的繁殖性能。由于CPPs可促進(jìn)公豬精子對(duì)鈣離子的吸收，因此CPPs可使豬精子穿透率較早地達(dá)到最大，CPPs可使精子保持較長(zhǎng)時(shí)間的穿過(guò)能力。

綜上所述，CPPs充分顯示了其在飼料業(yè)上的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力，在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用主要是作為功能性的飼料添加劑使用，有些國(guó)家已將CPPs作為功能性添加劑應(yīng)用于飼料工業(yè)中。

3.3 CPPs在藥物中的應(yīng)用

CPPs是從天然蛋白中提取的多肽，具有致敏性小、無(wú)細(xì)胞毒性、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，因此充分運(yùn)用這些特點(diǎn)，可用于對(duì)佝僂病，牙科病和骨質(zhì)疏松癥等疾病的治療；制成抗蛀牙牙膏，漱口液或含片等，如澳大利亞墨爾本大學(xué)將CPPs加入一種糖果中，發(fā)現(xiàn)這種糖果誘發(fā)齲齒的幾率大大降低；廣州某公司成功研制一種CPPs有機(jī)鈣牙膏，這種新型牙膏投放市場(chǎng)后，僅2個(gè)月銷(xiāo)售額突破4 000萬(wàn)元^[25]。另外，還可將CPPs制成促進(jìn)動(dòng)物體外受精和細(xì)胞融合的生化制劑等^[26]。

4 CPPs的檢測(cè)方法

隨著CPPs作用機(jī)理、生理功能等方面基礎(chǔ)研究的不斷深入和鈣強(qiáng)化劑的推廣應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外將CPPs作為功能性食品添加劑添加到飼料及食品中，我國(guó)僅僅把它作為促鈣吸收劑。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于CPPs的檢測(cè)方法主要有乙醇沉淀法、鉬藍(lán)比色法、直接定磷法、等電聚焦電泳法（IEF）和高效液相色譜法（HPLC）等等。

作為食品添加劑的CPPs產(chǎn)品含有多種磷酸肽、非磷酸肽及少量的游離氨基酸的混合物，通常采用乙醇沉淀法測(cè)定其中磷酸肽含量，但該法專(zhuān)屬性差，不能用于食品中添加CPPs的測(cè)定。鉬藍(lán)比色法和離子交換-高效液相色譜法（IE-HPLC）^[27]等可測(cè)定CPPs中磷酸基團(tuán)的含量，但是由于CPPs中磷酸基團(tuán)的數(shù)目并不是確定的，所以也無(wú)法測(cè)定CPPs的含量。

龐廣昌等^[28]對(duì)直接定磷法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法、聚丙烯酰胺等電聚焦電泳（IEF）法進(jìn)行比較：直接定量法測(cè)定CPPs，方法操作簡(jiǎn)單，不需要很昂貴的儀器設(shè)備，重復(fù)性強(qiáng)，適于生產(chǎn)控制，但是測(cè)定結(jié)果偏高，而且該方法必須有除去無(wú)機(jī)磷和非蛋白含磷物的試驗(yàn)，否則不能用于測(cè)定CPPs含量；SDS-PAGE法測(cè)定CPPs，該方法所測(cè)定的是各條含磷蛋白帶的含磷量，所以不需要對(duì)樣品進(jìn)行無(wú)機(jī)磷和非蛋白磷的測(cè)定，但是該方法比直接定磷法要復(fù)雜得多，需要電泳儀等儀器設(shè)備、較多的化學(xué)藥品和操作技巧；IEF法除具有SDS-PAGE法測(cè)定CPPs的所有優(yōu)點(diǎn)外，其精確性、穩(wěn)定性和可操作性都是最好的，另外它還可以用于對(duì)提取方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)該方法可以同時(shí)得到CPPs各組分的等電點(diǎn)，而等電點(diǎn)是進(jìn)行蛋白、多肽提取、分離的重要參數(shù)。本方法的缺點(diǎn)是需要電泳儀器設(shè)備，兩性電解質(zhì)較昂貴，操作也需要一定的訓(xùn)練。結(jié)果表明：這3種方法都可以用來(lái)對(duì)CPPs進(jìn)行定量測(cè)定，但適用于不同情況，直接定磷法適用于產(chǎn)業(yè)測(cè)定；SDS-PAGE適用于CPPs的組分測(cè)定；而IEF則適用于較精確的測(cè)定。

牟光慶等^[29]用毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）對(duì)CPPs進(jìn)行了分離和測(cè)定，并研究出適宜電泳操作條件。試驗(yàn)結(jié)論為本方法前處理簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高，適用于保健食品鈣片中CPPs含量的測(cè)定，但是容易受食品中蛋白質(zhì)及一些鹽類(lèi)成分的干擾。

Lemieux等^[30]將分子篩色譜與反相高效液相色譜法（RP-HPLC）聯(lián)用，成功分離并鑒定多種CPPs。Miquel等^[31]采用RP-HPLC-ESI-MS/MS第1次成功地分離出12種CPPs。但該2種方法所需設(shè)備昂貴，對(duì)操作人員素質(zhì)要求高，不太適應(yīng)生產(chǎn)質(zhì)量監(jiān)控和產(chǎn)品測(cè)定。周杏琴等^[32]用反相C18液相制備色譜柱，經(jīng)過(guò)2次不同梯度的洗脫，得到了4種不同組分的CPPs。田隨安等^[33]將保健食品樣品處理后，采用不同比例的乙腈、0.1%醋酸溶液梯度洗脫，用帶有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀測(cè)定。賴(lài)奕堅(jiān)等^[34]用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS），以選擇離子模式（SIM）檢測(cè)鈣片中CPPs含量，馮鳳琴等^[35]采用HPLC測(cè)定奶粉中CPPs的含量，試驗(yàn)結(jié)果表明，2種方法前處理簡(jiǎn)便，專(zhuān)一性好，靈敏度高。雖然HPLC或與其它方法聯(lián)用優(yōu)點(diǎn)較多，但是由于不同的廠家生產(chǎn)的CPPs標(biāo)志峰含量存在差異，所以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)需要利用所使用廠家生產(chǎn)的CPPs作為標(biāo)品，這也是高效液相色譜法存在的缺陷。

5 結(jié)語(yǔ)

由于我國(guó)民眾膳食組成以植物性食物為主，其中含有大量的影響鈣、鐵、鋅吸收因子，如植酸、草酸、纖維素等，沒(méi)有大量消費(fèi)乳制品的習(xí)慣，所以缺鈣尤為嚴(yán)重。隨著生活水平的提高，人類(lèi)鈣營(yíng)養(yǎng)不足的問(wèn)題備受關(guān)注，尤其是嬰兒和老年人。CPPs是安全性高的鈣促進(jìn)因子，作為一種營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑不斷地被添加到很多保健品中，但是，國(guó)內(nèi)外對(duì)于其檢測(cè)方法仍沒(méi)有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。因此，尋找一種更加精確、靈敏度更高、適用性更強(qiáng)的檢測(cè)方法成為當(dāng)務(wù)之急。

參考文獻(xiàn)：

[1] 牟光慶, 曹冬梅. 酪蛋白磷酸肽 (CPPS) 理化性質(zhì)的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2003, 24(10): 125-127.

[2] 楊玉紅. 酪蛋白磷酸肽的生物學(xué)活性及應(yīng)用[J]. 生物學(xué)教學(xué), 2011, 36(6): 8-10.

[3] MELLANDER O. The physiological importance of the casein in phosphopepfide calcium salts.Ⅱ Peroral calcium dosage in infant[J]. Acat Soc Med Ups, 1950(55): 247-255.

[4] LEE Y S, NOGUCHI T, NAITO H. Intestinal absorption of calcium in rats given diets containing casein or amino acid mixture: the role of casein phosphopeptides[J]. Br J Nutr, 1983(49): 67-76.

[5] SATO R. Casein phosphopeptides enhance calcium absorption from the ligated segment of rat small intestine[J]. Nutr Sci Vitaminal, 1986(32): 67-76.

[6] ERBA D, CIAPPELLANO S . Testolin G.Effect of the ratio of casein phosphopeptides to calciu m(w/w) on passive calcium transport in the distal small intestine of rats[J]. Nutrition, 2002, 18(9): 745-746.

[7] 馮鳳琴, 許時(shí)嬰, 王璋. 酪蛋白磷酸肽 (CPPs) 的分子量及持鈣功能的分析[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 1997, 23(2): 18-21.

[8] 馮鳳琴, 許時(shí)嬰, 王璋. 酪蛋白磷酸肽功能性質(zhì)的體外研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 1997, 23(6): 1-5.

[9] 生慶海, 耿倩, 邱泉名. 酪蛋白磷酸肽 (CPP) 對(duì)生長(zhǎng)期大鼠骨密度的影響[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2006, 34(5): 22-25.

[10] ZONG H, PENG L J, ZHANG S S, et al. Effects of molecular structure on the calcium-binding properties of

phosphopeptides[J]. Eur Food Res Technol, 2012(235): 811- 816.

[11] 王青華, 趙征. 酪蛋白磷酸肽 (CPP) 的開(kāi)發(fā)趨勢(shì)及應(yīng)用前景[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2007, 28(5): 146-149.

[12] ETCHEVERRY P, WALLINGFORD JC, MILLER DD, et al . Calcium, Zinc and iron Bioavailabilities from

Commercial Human Milk Fortifier: A Comparison Study[J]. Dairy Sci, 2004, 11(87): 3629-3637.

[13] REYNOLDS EC. Remineralization of enamel subsurface lesions by casiein phosphopeptides calciumsolutions[J]. Journal J Dent Res, 1997, 76(9): 1587-1596.

[14] CROSS K J, HUQ N L, STANTON D P, et al. NME studies of a novel calcium. phosphate and fluoride delivery vehicle-αS1-casein(59-79) by stabilized amorphous calcium fluoride phosphate nanocomplexes [J]. Biomaterials, 2004, 25(20): 5061-5069.

[15] YAMAGUCHI K, MIYAZAKI M, TAKAMIZAWA T, et al. Effect of CPP-ACP paste on mechanical properties of bovine enamel as determined by an ultrasonic device[J]. J Dent, 2006, 34(3): 230-236.

[16] 喻明玲, 林居紅, 胡赟. 酪蛋白磷酸肽-無(wú)定形磷酸鈣對(duì)酸蝕牙釉質(zhì)顯微硬度的影響[J]. 第3軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 35(02): 138-141.

[17] 謝瑋, 宮學(xué)詩(shī). 酪蛋白磷酸肽的毒性研究[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)信息, 2003, 9(5): 573-574.

[18] 徐曼, 何東平, 衛(wèi)娜. 酪蛋白磷酸肽持鈣能力的研究[J].現(xiàn)代食品科技, 2012, 28(3): 278-281.

[19] 李書(shū)國(guó), 陳輝, 李雪梅. 含低聚異麥芽糖酸豆乳飲料研制[J]. 糧食與油脂, 1999(3): 26-27.

[20] 胡志和, 龐廣昌, 陳慶森, 等. 食品加工條件及主要成分對(duì)CPPs延緩磷酸鈣沉淀能力的影響[J]. 食品科學(xué), 2002, 23(1): 39-43.

[21] 趙祥忠, 陸曉濱, 燕斌. 低聚糖補(bǔ)鈣型保健雪米餅的研制[J]. 糧油加工與食品機(jī)械, 2003(8): 60-62.

[22] 周根來(lái), 楊曉志, 高勤學(xué), 等. 酪蛋白磷酸肽對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和免疫功能的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011(1): 253-255.

[23] ASHIDA K. Effect of Dietary Casein Phosphopeptides and Calcium Levels on Eggshell Quality and Bone Status in Laying Hens[J]. Animal Science Tech, 1996, 67(11): 967- 974.

[24] 李如蘭, 王立克, 章文, 等. 酪蛋白磷酸肽對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能的影響[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2012(21): 61-62.

[25] 安景萍, 張丹鳳. 酪蛋白磷酸肽 (CPP) 生理功能及應(yīng)用[J]. 新疆畜牧業(yè), 2004(5): 23-24.

[26] 蔡太生. 酪蛋白磷酸肽的生理機(jī)能及應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械, 2011(2): 128-130.

[27] MIQUEL E ,ALEGR í A A,BARBER á R. Microde termination of phosphorus from infant formulas,casein and casein phosphopeptides[J]. Eur Food Res Technol, 2004(219): 639-642.

[28] 龐廣昌, 朱文欣. 酪蛋白磷酸肽(CPPs)測(cè)定方法的研究[J].食品科學(xué), 2001, 22(5): 49-52.

[29] 牟光慶, 張麗萍, 王立民, 等. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳測(cè)定酪蛋白磷酸肽方法的研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2002, 2(2): 21-24.

[30] LEMIEUX L. HPLC of casein hydrolysates phosphorylated and dephosphorylated[J]. J Chromatogr, 1990(519): 229-321.

[31] MIQUEL E. Speciation analysis of calcium, iron, and zinc in casein phosphopeptide fractions from toddler milk-based formula by anion exchange and reversed-phase-high-performance Iiquid chromatography-mass spectrometry/flame atomic-absorption spectroscopy[J]. Anal Bioanal Chem, 2005(381): 1082-1088.

[32] 周杏琴. 反相高效液相色譜分離酪蛋白磷酸肽[J]. 分析儀器, 2002(4): 19-21.

[33] 田隨安, 張向兵, 李永利. HPLC法測(cè)定保健食品中酪蛋白磷酸肽[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2007, 17(2): 273, 306.

[34] 賴(lài)奕堅(jiān), 陳閩軍, 劉玉敏, 等. LC-MS法測(cè)定鈣片中酪蛋白磷酸肽含量[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(12): 672-674.

[35] 馮鳳琴, 陳閩軍, 杜永盛, 等. 高效液相色譜法測(cè)定奶粉中酪蛋白磷酸肽(CPPs)含量[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2006, 6(3): 128-132