小麥肽的抗氧化與抗疲勞作用研究

王倩倩1，杜鵑2，陳鳴2，馮鳳琴1,*

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310012；

2.杭州康源食品科技有限公司，浙江杭州310012)

摘要：目的：探討小麥肽的體外抗氧化活性和體內(nèi)抗疲勞作用。方法：通過(guò)H2O2誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞L929構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型，測(cè)定損傷后L929細(xì)胞的存活率、乳酸脫氫酶(lacticdehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物(glutathioneperoxidedismutase,GSH-Px)活力以及丙二醛(MDA)含量，從細(xì)胞水平評(píng)價(jià)小麥肽的抗氧化作用。然后通過(guò)力竭游泳和自由泳實(shí)驗(yàn)，測(cè)定力竭游泳時(shí)間、乳酸(lacticacid,LA)、尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)和肌糖原(muscleglycogen,MG)含量、SOD和GSH-Px)活力以及MDA含量，來(lái)評(píng)價(jià)小麥肽的體內(nèi)抗疲勞和抗氧化作用。結(jié)果：小麥肽濃度在0.4、0.8mg/mL時(shí)對(duì)L929細(xì)胞的H2O2損傷有極顯著的保護(hù)作用；與模型組相比，小麥肽濃度為0.6和0.8mg/mL時(shí)的LDH活力分別顯著下降了20.79%和19.67%、SOD活力分別顯著和極顯著的提高了83.21%和95.19%、GSH-Px活力分別提高了28.69%和32.14%，MDA含量分別顯著下降了25.91%和26.99%。體內(nèi)抗疲勞實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，2個(gè)劑量組的小鼠力竭游泳時(shí)間分別顯著延長(zhǎng)了72.93%和91.73%，LA含量分別極顯著下降了24.65%和25.16%、BUN含量分別極顯著和顯著下降了19.74%和17.78%，MG含量分別極顯著提高了48.63%和56.85%；體內(nèi)抗氧化結(jié)果表明，2個(gè)劑量組的SOD和GSH-Px活力分別極顯著提高了20.54%、25.91%和29.79%、35.77%，MDA含量分別極顯著下降了23.08%和21.46%。Pearson相關(guān)性分析表明小麥肽的體內(nèi)抗疲勞與抗氧化作用高度相關(guān)。結(jié)論：小麥肽具有顯著的抗氧化和緩解疲勞作用，且抗氧化活性與抗疲勞作用高度相關(guān)。

關(guān)鍵詞：小麥肽，小鼠，抗氧化，抗疲勞，自由基

StudyontheAntioxidantand

Anti-fatigueEffectofWheatPeptides

WANGQian-qian1,DUJuan2,CHENMing2,FENGFeng-qin1,*

(1.CollegeofBiosystemsEngineeringandFoodScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310012,China;

2.HangzhouKangyuanFoodScience&TechnologyCo.,Ltd,Hangzhou310012,China)

Abstract: Objective: To investigate the in vitro antioxidant activity and in vivo anti-fatigue effect of wheat peptides. Methods: The oxidative stress model was established by treating L929 cells with H2O2. Then the cell survival rate, the activity of lactic dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxide dismutase (GSH-Px), and the content of malondialdehyde (MDA) were measured to evaluate the antioxidant activity of wheat peptides in vitro. In addition, the exhaustive swimming and freestyle swimming test was assessed. Then the exhaustive swimming time, the content of lactic acid (LA), blood urea nitrogen (BUN), muscle glycogen (MG) and MDA, the activity of SOD and GSH-Px were measured to studied the anti-fatigue and antioxidant of wheat peptides in vivo. Results: The wheat peptides in the concentration range from 0.4 to 0.8 mg/mL could protect L929 cells against H2O2-induced oxidative damaged as indicated by highly significantly increased the survival rate. Compared to the model group, the activity of LDH of the wheat peptides at 0.6 and 0.8 mg/mL was significantly decreased by 20.79% and 19.67%, the activity of SOD was highly significantly and significantly increased by 83.21% and 95.19%, the activity of GSH-Px was increased by 28.69% and 32.14%, and the content of MDA was significantly decreased by 25.91% and 26.99%. Compared with the control group, the exhaustive swimming time of the wheat peptides at 2 and 8 mg/mL was significantly increased by 72.93% and 91.73%, the content of LA was significantly decreased by 24.65% and 25.16%, the content of BUN was highly significantly and significantly decreased by 19.74% and 17.78%, and the content of MG was highly significantly increased by 48.63% and 56.85%. At the same time, the activity of SOD and GSH-Px was highly significantly increased by 20.54% and 25.91%, 29.79% and 35.77%, and the content of MDA was highly significantly decreased by 23.08% and 21.46%. Pearson correlation analysis showed that the antifatigue effect of wheat peptides was highly correlated with its antioxidant activity. Conclusion: Wheat peptide had significant antioxidant activity and anti-fatigue effect, and the anti-fatigue effect of wheat peptide was correlated with antioxidant activity.

Key words: wheat peptides; mice; antioxidant; anti-fatigue; free radical

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Adoi:10.13386/j.issn1002-0306.2020100066

近年來(lái)，隨著生活節(jié)奏的加快和社會(huì)壓力的增大，大部分人都處于亞健康的狀態(tài)，因此越來(lái)越多人開(kāi)始通過(guò)各種運(yùn)動(dòng)方式來(lái)提升自己的身體機(jī)能。在正常情況下，合理的體育鍛煉有助于身體更好的發(fā)揮功能。但由于自身?xiàng)l件的不同以及運(yùn)動(dòng)量的不合理，他們經(jīng)常會(huì)因?yàn)檫^(guò)度的運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致身體的不適，引起身體的疲勞，從而影響工作效率，甚至造成各種運(yùn)動(dòng)性損傷，危及損害身體健康^[1]。關(guān)于運(yùn)動(dòng)性疲勞的機(jī)制有幾種學(xué)說(shuō)，包括耗竭學(xué)說(shuō)、阻塞學(xué)說(shuō)、自由基學(xué)說(shuō)、內(nèi)環(huán)境失調(diào)學(xué)說(shuō)、保護(hù)性抑制學(xué)說(shuō)和突變學(xué)說(shuō)^[2]。其中自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為機(jī)體在高強(qiáng)度或長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的自由基，如羥基自由基和超氧陰離子自由基，過(guò)多的自由基會(huì)破壞體內(nèi)氧化和抗氧化平衡，引起肝臟和骨骼肌線粒體的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，最終導(dǎo)致疲勞^[3]。因此保護(hù)機(jī)體不受氧化傷害是預(yù)防疲勞的有效方法^[4-5]。外源性抗氧化物質(zhì)能與內(nèi)源性自由基相互作用，減少機(jī)體氧化損傷、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御能力、減少疲勞產(chǎn)生。近年來(lái)，營(yíng)養(yǎng)干預(yù)特別是多肽類(lèi)營(yíng)養(yǎng)保健品受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注，大量研究表明多肽在緩解疲勞方面是安全有效的^[6-8]。與蛋白質(zhì)相比，多肽類(lèi)補(bǔ)充劑能夠被機(jī)體更快更好地吸收，且能夠加快氨基酸、蛋白質(zhì)和葡萄糖的利用速率^[9]。

小麥肽是小麥蛋白經(jīng)過(guò)酶解得到的結(jié)構(gòu)片段，其氨基酸含量均衡，具有多種功能活性，如抗氧化^[10-11]、解酒^[12]、免疫調(diào)節(jié)^[13-14]、降血糖^[15]、保護(hù)腸粘膜^[16]、促進(jìn)胃粘膜修復(fù)^[17]等。研究表明酶解產(chǎn)物的氨基酸組成可能與其生物活性有關(guān)^[18]。小麥肽氨基酸組成中谷氨酸的含量最高，而谷氨酸中谷氨酰胺含量豐富^[19]。谷氨酸對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有積極的作用并且在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中是有用的^[20]，谷氨酰胺是谷胱甘肽合成的重要底物，在機(jī)體的抗氧化體系中具有重要作用。運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激之間存在著很大的關(guān)系，已經(jīng)成為抗疲勞領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。但目前關(guān)于小麥肽的功能活性研究主要集中在小麥肽的體外抗氧化方面，而對(duì)體內(nèi)抗疲勞的研究較少。另外小麥肽作為一種新的食品原料來(lái)源尚未得到廣泛應(yīng)用。因此，我們以小麥肽為研究對(duì)象，利用H2O2誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞L929氧化損傷，從細(xì)胞水平評(píng)價(jià)小麥肽的體外抗氧化活性，然后通過(guò)給予小鼠灌胃小麥肽30天，測(cè)定小鼠力竭游泳時(shí)間和與疲勞相關(guān)的生化指標(biāo)，探討小麥肽的抗疲勞作用，并探求體內(nèi)抗氧化活性和抗疲勞作用之間的相關(guān)性，從氧化應(yīng)激的角度來(lái)解釋小麥肽的抗疲勞機(jī)制，以期為小麥肽作為功能性食品基料提供數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1材料與儀器

小鼠成纖維細(xì)胞L929購(gòu)買(mǎi)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，L929細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清和1%雙抗，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至80%以上后，進(jìn)行傳代。SPF級(jí)ICR雄性小鼠64只，體重約(20±2)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)為SYXK(浙)2018-0012，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及飲水，保持環(huán)境溫度(25±2)℃，光照周期12h:12h條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后使用。乳清蛋白粉購(gòu)于市場(chǎng)；胎牛血清浙江天杭生物科技股份有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、雙抗(青霉素、鏈霉素)、0.25%胰酶上海源培生物科技股份有限公司；乳酸(LA)、尿素氮(BUN)、肌糖原(MG)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒南京建成生物工程研究所；其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋常州澳華儀器有限公司；PB-10pH計(jì)、BSA224S電子分析天平賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；752型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司；Ultimate3000高效液相色譜儀美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)安徽中佳科學(xué)儀器有限公司；InfiniteM200Pro酶標(biāo)儀瑞士帝肯集團(tuán)公司；MCO-170AICUVDL-PCCO2細(xì)胞培養(yǎng)箱日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社；DM500光學(xué)顯微鏡徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小麥肽的制備稱(chēng)取一定量的谷朊粉，調(diào)節(jié)料液的pH至8.0，添加0.4%蛋白酶，于50℃下酶解1.5h后置于沸水浴中滅酶30min，經(jīng)濃縮、噴霧干燥制得小麥肽。

1.2.2小麥肽特性的測(cè)定

1.2.2.1氨基酸組成采用異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法[21]測(cè)定小麥肽的氨基酸組成。樣品溶解于6mol/LHCl，然后于110℃水解24h后冷卻，取6μL水解液置于離心管中，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?/span>10μL再干燥液，吹干后加入20μL衍生溶液混勻，室溫靜置20min后再次氮?dú)獯蹈?，加?/span>50μL流動(dòng)相B，混勻后加入450μL流動(dòng)相A，過(guò)膜上機(jī)。

色譜條件：色譜柱為WelchAQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相A為0.1mol/L乙酸鈉溶液(含3%乙腈和0.1%三乙胺)，流動(dòng)相B為80%乙腈；流速1.0mL/min；柱溫38℃；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

1.2.2.2相對(duì)分子質(zhì)量分布采用凝膠過(guò)濾色譜測(cè)定小麥肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布^[22]。色譜條件：色譜柱為TSKgelG2000SWXL(300mm×7.8mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-超純水-三氟乙酸(體積比45:55:0.1)；流速0.5mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。

1.2.3體外抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1細(xì)胞損傷模型的建立選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，稀釋細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×10⁴個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔接種100μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，棄去舊培養(yǎng)基，然后進(jìn)行分組：空白組不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基；對(duì)照組加入不含H2O2的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的H2O2(40、80、120、160、200、250、300、350μmol/L)。24h后，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活情況，通過(guò)公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3.2小麥肽對(duì)L929細(xì)胞生長(zhǎng)的影響選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，稀釋細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×10⁴個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔接種100μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。24h后，棄去舊培養(yǎng)基，然后進(jìn)行分組：空白組不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基；對(duì)照組加入不含樣品的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的小麥肽(0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL)。24h后，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活情況，通過(guò)公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3.3小麥肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)L929細(xì)胞損傷的保護(hù)作用選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，稀釋細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×10⁴個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔接種100μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，棄去舊培養(yǎng)基，然后進(jìn)行分組：實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的小麥肽(0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL)；正常對(duì)照組和H2O2損傷組加入不含樣品的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后棄去舊培養(yǎng)基，H2O2損傷組和樣品組加入300μmol/L的H2O2，正常組加入不含H2O2的完全培養(yǎng)基，作用24h后，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活情況，通過(guò)公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率^[23]。

1.2.3.4抗氧化指標(biāo)測(cè)定選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，稀釋細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×10⁴個(gè)/mL，接種于6孔板中，每孔接種2mL。培養(yǎng)24h后進(jìn)行分組：正常對(duì)照組、H2O2模型組、不同濃度小麥肽組(0.4、0.6、0.8mg/mL)。細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同樣品和H2O2處理后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液進(jìn)行各指標(biāo)的測(cè)定。分別用試劑盒提供的方法測(cè)定上清液中LDH活力，細(xì)胞內(nèi)SOD活力、GSH-Px活力和MDA含量。

1.2.4抗疲勞實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1動(dòng)物分組及給藥雄性ICR小鼠64只，體重約(20±2)g，按照體重隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組(蒸餾水，同等劑量)、陽(yáng)性組(乳清蛋白，2mg/g/d)、小麥肽低劑量組(2mg/g/d)、小麥肽高劑量組(8mg/g/d)，每組16只，根據(jù)小鼠重量給予不同劑量的受試物，灌胃量按0.1mL/10g，每日1次，連續(xù)30d，灌胃期間自由取食和飲水。灌胃30d后，將每組的16只小鼠隨機(jī)分為2個(gè)亞組(每個(gè)亞組8只小鼠)，即A組和B組，A組小鼠用于力竭游泳實(shí)驗(yàn)，B組小鼠用于自由泳實(shí)驗(yàn)測(cè)定抗疲勞相關(guān)生化指標(biāo)。具體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Table1Experimentaldesignofanimals

1.2.4.2力竭游泳實(shí)驗(yàn)?zāi)┐喂辔?/span>30min后，將每組中的A組小鼠用肥皂水洗去其體表油脂，然后在小鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛絲，放入水溫25℃、水深約30cm的游泳箱中游泳。游泳期間若有躬腰停止、懸浮休息者，用玻璃棒攪動(dòng)附近水流迫使其不停運(yùn)動(dòng)。用秒表記錄自游泳開(kāi)始至小鼠頭部全部沉入水中7s不能浮出水面的時(shí)間，該時(shí)間作為小鼠的力竭游泳時(shí)間。

1.2.4.3疲勞相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定末次灌胃30min后，將每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的B組小鼠眼球取血，靜置15min后，離心取上清液，-80℃保存?zhèn)溆?。然后將采血后的小鼠立即處死，?/span>出肝臟和后腿肌肉，按照1:9的比例加入相應(yīng)體積的生理鹽水，磨勻漿后得到10%的組織勻漿液，-80℃保存?zhèn)溆?。分別用試劑盒提供的方法測(cè)定小鼠血清中LA和BUN含量、肌肉中MG含量、肝臟中MDA含量、SOD和GSH-Px活力。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析比較組間差異，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)圖表用GraphPadPrism8.0軟件制作。

2.1氨基酸組成和相對(duì)分子質(zhì)量分布

圖1小麥肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布

Fig.1Relativemolecularweightdistributionofwheatpeptides

肽的生物活性與其氨基酸組成相關(guān)。由表2可知，小麥肽含有18種肽的生物活性與其氨基酸組成相關(guān)。由表2可知，小麥肽含有18種氨基酸，總量為76.66%，表明小麥肽含有豐富的氨基酸組成。其中谷氨酰胺和脯氨酸是最主要的氨基酸，含量分別為22.91%和9.92%。而谷氨酰胺是一種重要的具有特殊營(yíng)養(yǎng)作用的條件性必需氨基酸及腸道必需氨基酸，它在保護(hù)細(xì)胞膜的完整性、維持細(xì)胞活力及降低細(xì)胞氧化損傷方面具有積極的作用^[24]。半胱氨酸含有可電離的硫醇基團(tuán)，能夠清除自由基并結(jié)合金屬離子^[25]；組氨酸結(jié)構(gòu)上含有咪唑環(huán)，可以與金屬離子和活性氧結(jié)合^[26]；甲硫氨酸含有硫醚基團(tuán)，對(duì)特定氧化劑有反應(yīng)^[27]；酪氨酸含有酚羥基，通過(guò)提供氫原子來(lái)清除活性氧^[28]。因此，以上4種氨基酸被普遍認(rèn)為具有抗氧化活性^[29]。另外，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸這類(lèi)支鏈氨基酸不僅可以明顯改善運(yùn)動(dòng)能力，延緩運(yùn)動(dòng)過(guò)程中肌肉蛋白質(zhì)的分解代謝，而且還能減少運(yùn)動(dòng)后乳酸的積累，從而延緩血乳酸引起的疲勞。由表2可知，小麥肽中具有抗氧化活性的半胱氨酸、組氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸這4種氨基酸含量為6.31%。同時(shí)，小麥肽中亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸這3種支鏈氨基酸的含量較高為13.22%。因此，小麥肽富含抗氧化與抗疲勞活性的氨基酸，推測(cè)其可能具有一定的抗氧化與抗疲勞的潛能。

除了氨基酸組成，肽的生物活性也取決于其相對(duì)分子質(zhì)量的分布，分子量小于3000Da的肽被認(rèn)為比分子量大于3000Da的肽具有更好的抗氧化活性，這種較好的活性可能是由于分子量小的肽段具有高活性、易吸收和低毒性^[30]。由表3可知，小麥肽相對(duì)分子質(zhì)量小于3000Da的部分占70.56%，推測(cè)其具有一定的抗氧化效果。

2.2體外抗氧化

2.2.1小麥肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)L929細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

圖2小麥肽對(duì)L929細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

Fig.2ProtectiveeffectofwheatpeptidesagainstH2O2inducedoxidativedamageinL929cells

注：與對(duì)照組相比，*代表差異顯著P＜0.05，**代表差異極顯著P＜0.01；與模型組相比，#代表差異顯著P＜0.05，

##代表差異極顯著P＜0.01，圖3同。

通過(guò)H2O2處理小鼠成纖維細(xì)胞L929制備氧化應(yīng)激損傷模型，來(lái)探討小麥肽的體外抗氧化活性。如圖2A所示，與對(duì)照組相比，當(dāng)H2O2濃度為300μmol/L作用24h時(shí)，細(xì)胞存活率為52.39%，因此選擇該濃度的H2O2進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。如圖2B所示，與對(duì)照組相比，濃度在0.2~0.8mg/mL范圍內(nèi)的小麥肽對(duì)L929細(xì)胞均具有增殖作用，濃度為0.4mg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng)，且差異極顯著(P＜0.01)。當(dāng)濃度大于0.8mg/mL時(shí)，小麥肽對(duì)L929細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用。因此我們選擇濃度為0.2~0.8mg/mL的小麥肽進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。小麥肽對(duì)L929細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用結(jié)果如圖2C所示。與模型組相比，在H2O2損傷前24h加入0.2~0.8mg/mL的小麥肽均能提高L929細(xì)胞的存活率，且隨著濃度的升高，細(xì)胞存活率隨之增加。當(dāng)小麥肽濃度為0.6mg/mL時(shí)，對(duì)L929細(xì)胞的保護(hù)作用最顯著(P＜0.01)，此時(shí)細(xì)胞存活率比模型組的提高了45.62%。綜合兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小麥肽濃度為0.4~0.8mg/mL時(shí)對(duì)H2O2誘導(dǎo)L929細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用較顯著(P＜0.01)。

2.2.2小麥肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)L929細(xì)胞損傷的抗氧化水平的影響正常細(xì)胞經(jīng)由H2O2處理后，細(xì)胞膜被破壞從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的LDH釋放。因此，上清液LDH活力的高低可反映出細(xì)胞的損傷程度。由圖3A可知，L929細(xì)胞經(jīng)H2O2損傷后細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力極顯著升高了53.10%(P＜0.01)，說(shuō)明模型建立成功。與模型組相比，小麥肽濃度為0.4、0.6和0.8mg/mL時(shí)LDH的活力分別減少了7.20%、20.79%和19.67%，且濃度在0.6mg/mL和0.8mg/mL時(shí)差異達(dá)到顯著(P＜0.05)。SOD和GSH-Px是機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化酶，SOD催化活性氧分解生成H2O2和O2，GSH-Px催化H2O2分解生成H2O和O2，它們能直接反應(yīng)機(jī)體的抗氧化水平。而MDA是自由基引起脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一，可間接顯示機(jī)體清除氧化產(chǎn)物能力和抗氧化活性[31]。由圖3B和圖3C可知，與模型組相比，小麥肽濃度為0.4、0.6和0.8mg/mL時(shí)SOD活力提高了23.55%、83.21%和95.91%，且在濃度為0.6mg/mL和0.8mg/mL時(shí)差異達(dá)到顯著(P＜0.05)和極顯著(P＜0.01)；同時(shí)GSH-Px活力提高了11.38%、28.69%和32.14%，但差異均不顯著(P＞0.05)。由圖3D可知，3個(gè)濃度的小麥肽使得細(xì)胞內(nèi)的MDA含量降低了10.52%、25.91%和26.99%，且在濃度為0.6mg/mL和0.8mg/mL時(shí)差異達(dá)到顯著(P＜0.05)。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明小麥肽具有抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激的潛力。

圖3小麥肽對(duì)L929細(xì)胞氧化損傷LDH、SOD、GSH-Px和MDA水平的影響

Fig.3EffectofwheatpeptidesagainstH2O2inducedoxidativedamageinL929cellsontheSOD,GSH-Px,MDAandLDH

2.3.1體重變化由表4可知，在實(shí)驗(yàn)期間，各樣品組與對(duì)照組小鼠的體重均有所增加，但體重變化無(wú)顯著性差異。灌胃期間，小鼠無(wú)不良反應(yīng)，體質(zhì)量增加正常，精神狀態(tài)良好，未發(fā)現(xiàn)異?；蛘咚劳霈F(xiàn)象，表明灌胃小麥肽并不會(huì)影響小鼠的正常生長(zhǎng)，對(duì)小鼠無(wú)毒副作用。

2.3.2小麥肽對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間和抗疲勞指標(biāo)的影響

圖4小麥肽對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間、乳酸、尿素氮和肌糖原水平的影響

Fig.4Effectofwheatpeptidesontheexhaustiveswimmingtime,LA,BUNandMG

注：與對(duì)照組相比，*代表差異顯著P＜0.05，**代表差異極顯著P＜0.01，圖5同。

力竭游泳時(shí)間是評(píng)價(jià)抗疲勞能力的一種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，它能夠很好地評(píng)價(jià)小鼠的疲勞耐受能力，再現(xiàn)性較高^[32]。由圖4A可知，小麥肽低劑量組、高劑量組和乳清蛋白組小鼠的力竭游泳時(shí)間較對(duì)照組均有極顯著差異(P＜0.01)，分別延長(zhǎng)了72.93%、91.73%和64.66%，且高劑量組與乳清蛋白組有顯著差異(P＜0.05)。另外，隨著小麥肽劑量的增加，其力竭游泳時(shí)間也隨著延長(zhǎng)，表明在一定范圍內(nèi)，小鼠力竭游泳時(shí)間呈劑量依賴(lài)性。長(zhǎng)時(shí)間的劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)增加肌肉的氧氣消耗，導(dǎo)致機(jī)體相對(duì)缺氧，此時(shí)肌肉中的糖原會(huì)被分解產(chǎn)生乳酸，為機(jī)體提供能量。但大量的乳酸的產(chǎn)生則會(huì)影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡，引起肌肉酸痛，導(dǎo)致肌肉運(yùn)動(dòng)能力的下降。同時(shí)為了滿足能量需求，蛋白質(zhì)的代謝顯著增加，使肝臟中的尿素水平明顯增加，過(guò)量的尿素會(huì)在體內(nèi)積累并對(duì)機(jī)體造成危害。BUN的含量在一定程度上可以反映機(jī)體的疲勞程度^[33-34]。由圖4B和4C可知，與對(duì)照組相比，小麥肽低劑量和高劑量組均使得小鼠肝臟中的LA含量極顯著降低了24.65%(P＜0.01)、25.16%(P＜0.01)，同時(shí)BUN含量較對(duì)照組也極顯著和顯著降低了19.74%(P＜0.01)、17.78%(P＜0.05)，表明小麥肽可加快LA和BUN的清除速度，減少了代謝產(chǎn)物的堆積和體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝，具有改善能量代謝，加速疲勞消除的作用，從而提高了小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。糖原是體內(nèi)儲(chǔ)存能量的主要形式之一，能夠與糖在機(jī)體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化作用，肌糖原通過(guò)無(wú)氧酵解的途徑直接將能量供給肌肉組織[35]。由圖4D可知，小麥肽低劑量和高劑量組MG含量比對(duì)照組極顯著提高了48.63%(P＜0.01)、56.85%(P＜0.01)。根據(jù)《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》，若1項(xiàng)以上(含1項(xiàng))的運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和2項(xiàng)以上(含2項(xiàng))的生化指標(biāo)為陽(yáng)性，可判定該受試物具有抗疲勞作用。小麥肽低劑量和高劑量組的運(yùn)動(dòng)指標(biāo)和3項(xiàng)生化指標(biāo)均呈陽(yáng)性，說(shuō)明小麥肽通過(guò)延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間，降低運(yùn)動(dòng)小鼠血清中乳酸和尿素氮含量，減少運(yùn)動(dòng)引起的肌糖原消耗，具有顯著的抗疲勞作用。

2.3.3小麥肽對(duì)小鼠肝臟抗氧化水平的影響

圖5小麥肽對(duì)小鼠SOD、GSH-Px和MDA水平的影響

Fig.5EffectofwheatpeptidesontheSOD,GSH-PxandMDA

以往的研究表明，劇烈運(yùn)動(dòng)過(guò)程中消耗大量的能量，會(huì)使氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失去平衡，產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，如羥基自由基和超氧陰離子自由基，這些自由基極易引起骨骼肌與肝臟線粒體的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，從而削弱抗氧化能力。在劇烈運(yùn)動(dòng)中，人體對(duì)氧氣的需求會(huì)增加，骨骼肌的血流量也會(huì)改變。這些變化導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生和肌肉穩(wěn)態(tài)的紊亂，導(dǎo)致骨骼肌的氧化損傷，隨后的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步導(dǎo)致肌肉疲勞[36]。因此，清除活性氧可能是緩解肌肉疲勞的主要機(jī)制之一。由圖5A和5B可知，與對(duì)照組相比，小麥肽低劑量和高劑量組均使得小鼠肝臟中的SOD極顯著提高了20.54%(P＜0.01)、25.19%(P＜0.01)，同時(shí)GSH-Px活力較對(duì)照組也極顯著提高了29.79%(P＜0.01)、35.77%(P＜0.01)；由圖5C可知，與對(duì)照組相比，小麥肽低劑量和高劑量組均使得小鼠肝臟中的MDA含量極顯著降低了23.08%(P＜0.01)、21.46%(P＜0.01)。結(jié)果表明，小麥肽能夠提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶的活力，清除因運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的自由基，緩解疲勞，具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化能力。

2.3.4體內(nèi)抗氧化和抗疲勞的相關(guān)性分析我們將體內(nèi)抗氧化指標(biāo)和抗疲勞指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析[37]，得到結(jié)果如表5所示。從表中可以看到，各個(gè)處理組的SOD活力、GSH-Px活力與小鼠力竭游泳時(shí)間、MG含量呈正相關(guān)，與LA含量、BUN含量呈負(fù)相關(guān)；MDA含量與小鼠力竭游泳時(shí)間、MG含量呈負(fù)相關(guān)，與LA含量、BUN含量呈正相關(guān)。結(jié)果表明，小麥肽的抗疲勞活性與其抗氧化活性高度相關(guān)。

3結(jié)論

本研究通過(guò)H2O2處理小鼠成纖維細(xì)胞L929來(lái)制備氧化應(yīng)激損傷模型，從細(xì)胞水平評(píng)價(jià)小麥肽的體外抗氧化活性，然后通過(guò)給予小鼠灌胃小麥肽30d，測(cè)定小鼠力竭游泳時(shí)間和與疲勞相關(guān)的生化指標(biāo)，探討小麥肽的抗疲勞作用，并探求體內(nèi)抗氧化活性和抗疲勞作用之間的相關(guān)性。體外抗氧化結(jié)果表明，H2O2損傷導(dǎo)致L929細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞上清液中LDH漏出量增多且能夠顯著造成細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD和GSH-Px活性降低及細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的增加。但當(dāng)提前加入小麥肽對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)保護(hù)后，可通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性、減少MDA含量，發(fā)揮其抗氧化作用。體內(nèi)抗疲勞結(jié)果表明小麥肽通過(guò)延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間，降低運(yùn)動(dòng)后LA及BUN的水平，增加MG的含量，提高內(nèi)源性抗氧化酶體系的活力，減緩疲勞的發(fā)生。通過(guò)對(duì)體內(nèi)抗氧化和抗疲勞相關(guān)性分析可知，抗氧化活性與抗疲勞能力高度正相關(guān)，因此后續(xù)可進(jìn)行與氧化應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證。

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